Authors:	Olf, Mario
Title:	Funktionelle und strukturelle Analyse der Metalloprotease Nephrosin aus dem Zebrafisch (Danio rerio)
Online publication date:	3-Jan-2022
Year of first publication:	2022
Language:	german
Abstract:	Proteasen sind Enzyme, die in nahezu allen Prozessen von Lebewesen involviert sind. Aus diesem Grunde ist es von hohem Interesse die Lokalisation und die Regulationsmechanismen der verschiedenen Proteasen aufzuklären. In dieser Arbeit ist das zentrale Thema Nephrosin, eine Protease des Immunsystems von cyprinoiden Fischen. Während einer Infektion mit E. coli Bakterien im Zebrafisch (Danio rerio) wird die Metalloprotease Nephrosin vermehrt exripmiert. Die physiologische Funktion des Nephrosin bisher noch nicht aufgeklärt werden konnte. Die Translation von Nephrosin konnte in den hämatopoetischen Geweben, wie der Niere, Kopfniere, Milz und Kiemen, cyprinoider Fische nachgewiesen werden. Auf zellulärer Ebene konnte eine Cotranslation mit myeoloider Peroxidase gezeigt werden, was auf eine Genexpression in neutrophilen Granulozyten schließen lässt. In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen von Nephrosin eine höhere Sterblichkeit in dem Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) zur Folge hat. Somit scheint Nephrosin eine wichtige Rolle im Immunsystem von Fischen zu übernehmen. Zu Beginn dieser Arbeit waren in der Literatur Daten zur Lokalisation von Nephrosin vor allem auf RNA Ebene zu finden. Eine genaue Lokalisation des exprimierten Proteins auf zellulärer Ebene lag nicht vor. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nephrosin ab 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) als Protein in Zebrafischembryonen nachweisbar ist. Weiterhin ist es gelungen hochauflösende Aufnahmen des exprimierten Proteins in neutrophilen Granulozyten adulter Zebrafische anzufertigen. Diese zeigen, dass Nephrosin vorwiegend im peripheren Raum der Granulozyten lokalisiert ist und innerhalb der Zelle nicht mit der myeloiden Peroxidase kolokalisiert. Dies deutet auf eine Lokalisation in verschiedenen Granula innerhalb der neutrophilen Granulozyten hin. Neben der Lokalisation kommt der Regulation von Proteasen eine entscheidende Rolle zu, die bisher für Nephrosin im Detail nicht geklärt war. Mittels in silico Modellierungen konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Nephrosin durch Fetuin-B bzw. Fisch Fetuin analog zur Inhibition von Astacin mit Maus Fetuin-B funktioniert. Diese Inhibition konnte ebenfalls durch eine Inhibitorische Konstante (K i ) von 1,86* 10 -11 M ± 3,36 -12 M (Maus Fetuin-B) bzw. 3,64* 10 -9 M ± 5,87 -10 M (Fisch Fetuin) biochemisch quantifiziert werden. Nach einer Datenbankrecherche mit anschließenden Modellierungsversuchen konnten die Matrix Metalloproteasen MMP2 und MMP9 als mögliche Aktivatoren für Nephrosin identifiziert werden. Beide Proteasen spielen bei Entzündungsprozessen, wie sie auch bei Invasionen durch Pathogene hervorgerufen werden, eine Rolle, so dass eine physiologische Relevanz möglich ist. Somit konnte eine mögliche physiologische Regulation der Aktivierung und Inhibition des Nephrosin aufge- zeigt werden. Proteases are enzymes, which play an important role in nearly every process of all living beings. Therefore, it is of high interest to identify the localisation and regulatory mechanisms of prote-ases. During infections in zebrafish (Danio rerio) the metalloproteinase nephrosin is highly ex-pressed. Still, the physiological function of nephrosin is unclear. The expression of nephrosin in haematopoietic tissues like head kidney, kidney, spleen and gills of cyprinoid fish suggests an immunological function. A gen co-expression of nephrosin and myeloid peroxidase could be shown in neutrophil granulocytes of zebrafish. Another study revealed a higher death rate of the model organism zebrafish (Danio rerio) in absence of nephrosin when challenged with the bac-terium E. coli. All these findings indicate an important role of nephrosin in immune response of fish. A literature research for the localisation of nephrosin revealed that most data available were RNA investigations of nephrosin gene expression. A localisation of the nephrosin protein within cells was not shown in literature. In this study it could be shown that the nephrosin protein is expressed after 24 hours post fertilisation in zebrafish embryos. Furthermore, high resolution imaging of zebrafish kidney revealed a protein expression of nephrosin in neutrophil granulo-cytes of adult zebrafish. Here the nephrosin was found mostly in the peripheral space of the granulocytes, whereas myeloid peroxidase is not. It is known that granulocytes have different granules with different enzymes. Therefore, it seems that nephrosin and myeloid peroxidase are located in different granules. Besides the localisation of a protein its regulation is a crucial key point for controlling its protein function. A study of Tsung and colleagues showed, that nephrosin could be regulated by a pro-tein belonging to the fetuin family. But details of this regulation were not described until now. In silico modelling of nephrosin and fish fetuin showed a mechanism very closely related to mouse fetuin B and astacus astacin. FRET analyses of nephrosin revealed inhibitory constants (Ki) of this mechanism of 1,86* 10-11M ± 3,36-12 M (mouse fetuin B) or 3,64* 10-9 M ± 5,87-10 M (fish Fetuin). With the help of in silico analysis and modelling experiments, MMP2 (matrix metalloprotease 2) and MMP9 could be identified as potential activators of nephrosin. MMP9 is known to be pre-sent in neutrophilic granulocytes leading to a possible in vivo interaction during inflammatory processes or pathogen immune responses. MMP2 is also known to play a role in inflammatory processes. A possible in vivo regulation of nephrosin could be shown by characterisation of the activation and inhibition of nephrosin.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences 590 Tiere (Zoologie) 590 Zoological sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6621
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-e050b9bc-66e9-41d8-b56f-3a634db538a54
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IX, 76, iii, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen