Authors:	Morpurgo, Elena
Title:	NECAB2/MitoNEET represents an alternative activity-triggered mitochondrial quality control system NECAB2/MitoNEET repräsentiert ein alternatives aktivitätsinduziertes Kontrollsystem der mitochondrialen Qualität
Online publication date:	13-Dec-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	In recent years, more and more mitochondrial quality control (mtQC) pathways, sometimes overlapping, have been discovered. Neurons cannot proliferate and, at the same time, have high energy demands, requiring carefully orchestrated mtQC to ensure mitochondrial health. The mtQC pathways can, to some degree, compensate for each other (Hammerling et al., 2017); the impact of each one remains to be measured. This may help explain why most neurodegenerative diseases, whether sporadic or caused by gene mutations, usually manifest at an advanced age. In this thesis I propose a novel activity-triggered mitochondrial quality control (mtQC) mechanism actuated by neuronal calcium-binding protein 2 (NECAB2) and MitoNEET (mNT). NECAB2 is a protein primarily found in the striatum and was first described by Bernier et al. in 2001, while mNT was first described as a target of the type 2 diabetes drug pioglitazone by Colca et al. (2004). In my experiments, I was able to demonstrate that NECAB2, which was originally described as a cytosolic protein (Canela et al., 2009), is present at mitochondria and involved in mtQC. My mNT and NECAB2 colocalization studies were inconclusive, but mNT expression was increased in cells expressing NECAB2 compared to cells with no NECAB2 expression. I hence here propose a model for NECAB2-mediated mitochondrial quality control: high calcium levels caused by damaged mitochondria combined with low mitochondrial membrane potential (Δψm) represent a mitophagy-inducing “double-hit”. As speculated by Dey et al. (2021), high calcium levels would cause NECAB2’s localization to defective mitochondria. I hypothesize that NECAB2 then binds to phosphorylated or ubiquitinated mNT. Here, thanks to its ABM domain, NECAB2 degrades mNT’s 2Fe-2S cluster, thus tagging mitochondria for degradation. Concurrently, Karmi et al. (2017) proposed mNT plays a role in traditional autophagy. Furthermore, mNT is a Parkin ubiquitination substrate (Lazarou et al., 2013) and lowers the mitochondrial membrane potential (Δψm) (Kusminski et al., 2016). The ABM domain’s function in NECAB2 has not been uncovered yet, but analogous monooxygenases in prokaryotes degrade heme to ferrous iron (Lojek et al., 2017, Lyles and Eichenbaum, 2018). mNT KO in mice results in a Parkinson’s disease (PD) phenotype (Geldenhuys et al., 2017). NECAB2 KO in mice results in motor symptoms (Dey et al., 2021) and the expression of NECAB2 is upregulated in patients with sporadic PD and genetic PD mutations (Fernandez-Santiago et al., 2015, Schondorf et al., 2014). Along with Dey et al. (2021), I speculate NECAB2 could thus be involved in the etiology of PD, but also in amyotrophic lateral syndrome (ALS). Congruently, in human iPSCs-derived dopaminergic neurons, I was able to demonstrate NECAB2 and mNT upregulation in two different PINK1 KOs compared to their isogenic control. Given early endosomes’ continuous presence in the cell, Hammerling et al. (2017) propose they are a first-line defense against malfunctioning mitochondria. If the damage exceeds endosomal capacity, canonical autophagy is initiated. The results from my experiments lead me to conclude that NECAB2/mNT-dependent mtQC is also a first-line defense mechanism and therefore tags mitochondria for endolysosomal degradation, rather than traditional autophagy. Indeed, mitochondrial and endosomal colocalization in primary striatal neurons from NECAB2 WT and KO mice was about the same at baseline and dramatically increased in KO after treatment with the mitochondrial uncoupler FCCP. This is probably because mitochondrial distress caused by FCCP and KO (over-) activates other mtQC pathways involving Rab5 (an endosomal marker). The rest of my experiments to study Rab5’s implication in the NECAB2/mNT mtQC mechanism were inconclusive. However, in healthy human iPSCs- derived dopaminergic neurons, NECAB2 and Rab5 colocalization was significantly increased compared to the two PINK1 KOs. This has two potential explanations: if the NECAB2/mNT pathway is PINK1/Parkin-dependent, NECAB2 and mNT would not be degraded in PINK1 KO, explaining their higher levels in Western blot. Higher colocalization between Rab5 and NECAB2 in healthy cells could be a product of lower NECAB2 levels or it could be an indicator for better mtQC orchestration. On the other hand, if NECAB2/mNT can be phosphorylated by a kinase other than PINK1/Parkin, it could activate mitophagy in PINK1 KO cells while somewhat compensating PINK1/Parkin loss. In this case, however, I would have expected higher Rab5/NECAB2 colocalization in the PINK1 KO cells. To settle which of the two hypotheses is correct, more experiments need to be performed comparing single NECAB2 and PINK1 KO to double KO. In any case, NECAB2’s involvement in mtQC and upregulation in cells derived from PD patients make it an interesting potential therapeutic target in PD, but further experimental work is required. In den vergangenen Jahren wurden immer mehr Signalwege der mitochondrialen Qualitätskontrolle (mtQK) entdeckt, die sich zum Teil überschneiden. Neuronen sind nicht teilungsfähig und haben gleichzeitig einen hohen Energiebedarf, weswegen hier die mtQK eine besondere Rolle spielt. Die mtQK-Signalwege können sich in gewisser Hinsicht gegenseitig kompensieren (Hammerling et al., 2017); die Bedeutung der einzelnen Signalwege ist noch nicht abschließend geklärt. Dies erklärt ansatzweise, warum die meisten neurodegenerativen Erkrankungen – sowohl sporadisch auftretend als auch durch Genmutationen bedingt – eher im höheren Alter auftreten. In dieser Dissertation schlage ich einen neuen, durch Aktivität ausgelösten Signalweg der mitochondrialen Qualitätskontrolle vor, der durch das Neuronale Kalzium-bindende Protein 2 (NECAB2) und MitoNEET (mNT) vermittelt wird. NECAB2 ist ein vor allem im Striatum vorkommendes Protein und wurde zuerst von Bernier et al. 2001 beschrieben, während mNT als erstes von Colca et al. (2004) als Zielstruktur von Pioglitazon (ein Antidiabetikum) beschrieben wurde. In meinen Experimenten konnte ich zeigen, dass das ursprünglich als zytosolisch vorkommend beschriebene NECAB2 (Canela et al., 2009) auch an Mitochondrien vorkommt und in der mtQK eine Rolle spielt. Meine Experimente zur Kolokalisation von NECAB2 und mNT waren nicht eindeutig. Die Expression von mNT in NECAB2-exprimierenden Zellen war jedoch im Vergleich zu Zellen ohne NECAB2-Expression deutlich erhöht. Daher schlage ich folgendes Modell für die NECAB2-vermittelte mtQK vor: erhöhte Kalziumkonzentrationen (durch geschädigte Mitochondrien hervorgerufen), kombiniert mit niedrigem mitochondrialen Membranpotential (Δψm), stellen einen Mitophagie-induzierenden „Doppelschlag“ dar. Wie von Dey et al. (2021) vorgeschlagen, würden erhöhte Kalziumkonzentrationen NECAB2s Verlagerung an beschädigte Mitochondrien veranlassen. Ich stelle die Hypothese auf, dass NECAB2 dort an phosphoryliertes oder ubiquitiniertes mNT bindet. Dank seiner ABM-Domäne degradiert NECAB2 mNTs Eisen-Schwefel-Cluster und markiert somit Mitochondrien für den Abbau. Tatsächlich wurde mNT bereits von Karmi et al. (2017) als Interaktionspartner der traditionellen Autophagie vorgeschlagen. Zudem zeigten Lazarou et al. (2013), dass mNT von Parkin ubiquitiniert wird und Kusminski et al. (2016) bewiesen, dass mNT das mitochondriale Membranpotential (Δψm) vermindert. Die Funktion von NECAB2s ABM-Domäne ist noch nicht geklärt, ähnliche Monooxygenasen degradieren in Prokaryoten jedoch Häm zu Eisen (Lojek et al., 2017, Lyles and Eichenbaum, 2018). Knockout (KO) von mNT in Mäusen verursachte einen Parkinson-typischen Phänotyp (Geldenhuys et al., 2017). NECAB2-KO verursacht in Mäusen ebenso motorische Symptome (Dey et al., 2021). Des Weiteren ist NECAB2 sowohl bei Patienten mit sporadisch auftretendem als auch mit genetisch bedingtem Parkinson hochreguliert (Fernandez-Santiago et al., 2015, Schondorf et al., 2014). NECAB2 könnte daher in die Ätiologie von Parkinson, aber auch von amyotropher Lateralsklerose verwickelt sein (Dey et al., 2021). Erwartungsgemäß konnte ich in humanen, aus iPSC gewonnenen, dopaminergischen Neuronen eine Erhöhung von NECAB2 und mNT in zwei unterschiedlichen PINK1-KOs zeigen. Da sie kontinuierlich in der Zelle präsent sind, schlagen Hammerling et al. (2017) frühe Endosomen als erste Abwehr gegen geschädigte Mitochondrien vor. Ist die endosomale Kapazität überstiegen, wird die kanonische Autophagie initiiert. Ich vermute, dass NECAB2/mNT ebenso eine erste Abwehr darstellt und Mitochondrien für den endolysosomalen Abbau markiert. Tatsächlich stieg die anfangs in NECAB2-Wildtyp (WT) und -KO ungefähr gleiche mitochondriale-endosomale Kolokalisation nach Behandlung mit dem mitochondrialen Entkoppler FCCP stark in den KO-Zellen. Der durch FCCP und KO bedingte mitochondriale Stress (über-)aktiviert wahrscheinlich andere mtQK-Mechanismen, in denen der endosomale Marker Rab5 eine Rolle spielt. Die restlichen Experimente zu Rab5s Rolle im NECAB2/mNT-Signalweg waren unschlüssig. Interessanterweise war jedoch die Kolokalisation zwischen NECAB2 und Rab5 in gesunden humanen dopaminergischen Neuronen deutlich erhöht im Vergleich zu den zwei PINK1 KOs. Zwei Ansätze könnten dies erklären: falls der NECAB2/mNT-Signalweg PINK1/Parkin-abhängig ist, würden NECAB2 und mNT in PINK1 KO-Zellen nicht degradiert werden, was ihre höhere Konzentration im Western Blot erklären würde. Die höhere Kolokalisation von NECAB2 und mNT in gesunden Zellen könnte demnach eine Folge der niedrigeren NECAB2-Konzentration oder ein Zeichen der besser funktionierenden mtQK sein. Sollte hingegen eine andere Kinase mNT phosphorylieren, könnten NECAB2 und mNT die Mitophagie in PINK1 KO-Zellen aktivieren und den PINK1/Parkin-Verlust ansatzweise kompensieren. In diesem Falle hätte ich jedoch eine erhöhte Rab5/NECAB2-Kolokalisation in den PINK1 KO-Zellen erwartet. Um herauszufinden, welche der Hypothesen korrekt ist, müssten Experimente mit NECAB2-, PINK1- und doppeltem KO durchgeführt werden. In jedem Fall machen seine Beteiligung an der mtQK und seine Hochregulierung in Zellen von Parkinsonpatienten NECAB2 zu einem interessanten potentiellen therapeutischen Angriffspunkt. Um an diesen Punkt zu kommen, wären jedoch weitere Experimente notwendig.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6577
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-69485197-5789-49a9-8f9f-6c2e7c3e230b4
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-SA
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/
Extent:	X, 71, XV Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen