Authors:	Stiemcke, Valentin Theodor
Title:	Der Einfluss des Endocannabinoidsystems auf die Cortexentwicklung der Maus
Online publication date:	10-Nov-2021
Year of first publication:	2021
Language:	german
Abstract:	Der Neokortex stellt den phylogenetisch jüngsten Teil des Säugergehirns dar und seine Bildung während der Embryonalperiode ist ein komplex gesteuerter Prozess, der von intrinsischen und extrinsischen Einflussfaktoren abhängig ist. Im Verlauf der letzten Jahrzehnte wurde mit der Entdeckung des Endocannabinoidsystems auch dessen Bedeutung für die Entwicklung des Gehirns im Allgemeinen und des Neocortex im Speziellen beleuchtet. Das Endocannabinoidsystem ist ein retrogrades Neurotransmittersystem, das nahezu im gesamten Gehirn vorhanden ist und aus den Endocannabinoiden, hauptsächlich Anandamid und 2-Arachidonoylglycerol, deren auf- und abbauenden Enzymen und seinen Rezeptoren, dem Cannabinoidrezeptor 1 und dem Cannabinoidrezeptor 2 besteht. Während das Endocannabinoidsystem im adulten Gehirn durch Inhibition von exzitatorischen oder inhibitorischen Afferenzen sowohl hemmend als auch stimulierend wirken kann und hierdurch für eine neuroexzitatorische Balance sorgt, übernimmt es während der Entwicklung des Gehirns in der Embryonalphase viele wichtige Aufgaben, die sich von denen im adulten Gehirn unterscheiden: Neben einem Einfluss auf die Zellteilungsrate und die Migration von sich entwickelnden Neuronen, wird auch die Ausbildung von Zellfortsätzen und deren Verzweigung durch das Endocannabinoidsystem reguliert. Die Auswirkungen von erniedrigten AEA-Spiegeln wurden bisher jedoch lediglich in vitro untersucht. Da die Corticogenese jedoch ein dreidimensionaler, durch Umgebungsfaktoren beeinflusster Prozess ist, ist die Untersuchung dieser Vorgänge in vivo von Relevanz. In den letzten Jahren hat sich die Technik der in utero-Elektroporation zunehmend etabliert und konnte kürzlich für die gut untersuchte Mauslinie C57BL/6 optimiert werden. Mithilfe dieser Technik können Veränderungen an Embryonen in vivo vorgenommen werden, indem genetisches Material von außen eingebracht und per Elektroporation in Zellen des Zielgewebes eingeschleust wird. Im Anschluss kann die weitere physiologische Embryonalentwicklung voranschreiten und schließlich können die Auswirkungen der Veränderungen zu einem beliebigen Zeitpunkt untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zwei Plasmide konstruiert, die sich für die Verwendung im Rahmen der in utero-Elektroporation eignen und zu einer Überexpression des AEA abbauenden Enzyms FAAH in Zielzellen führen sollten. Als Vorlagevektor diente der etablierte eukaryotische Expressionsvektor pCAGIG, der neben dem starken CAG-Promotor über eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und das Reportergen GFP verfügt. In diesen Vektor wurde die FAAH-Sequenz zusammen mit einem HA-tag aus einem viralen Expressionsvektor einkloniert und die ordnungsgemäße Funktion des entstandenen Konstrukts überprüft. Daneben wurde ein zweiter Vektor generiert, der mithilfe eines floxed stops eine Cre- Rekombinase-abhängige und damit zelltypspezifische Expression von FAAH ermöglichen sollte. Außerdem wurden geeignete Techniken zur Auswertung von transfiziertem Gewebe untersucht. Mithilfe von Experimenten in Zellkultur konnte die ordnungsgemäße Funktion beider Vektoren durch Fluoreszenzmikroskopie und Proteinnachweismethoden bewiesen werden. Sie können in der Zukunft für die Untersuchung einer erniedrigten AEA- Konzentration auf die Entwicklung des Neocortex verwendet werden. Da physiologischerweise hauptsächlich glutamaterge Projektionsneuronen FAAH exprimieren, wäre für die Zukunft beispielsweise eine Kombination von pCAGIG- floxstop-HA-FAAH mit einer NEX-Cre-Maus von Interesse. Im Rahmen der Aufbereitung von transfiziertem Gewebe erwies sich eine Schnittdicke der Gefrierschnitte von 80 μm als optimal, während eine Präparation von Gewebe vor Fixierung zu besseren Ergebnissen führte als eine nachträgliche Präparation. Es wurde gezeigt, dass zur Identifikation erfolgreich transfizierter Areale ein immunhistochemischer Nachweis des Reportergens GFP dem reinen fluoreszenzmikroskopischen Nachweis von nativem GFP vorzuziehen ist. Maßgebliche Einflussfaktoren der Transfektionseffizienz waren die Dauer des Eingriffs, der sichere Kontakt der Elektrodenpinzette zu dem zu elektroporierenden Gewebe und eine vorsichtige Injektion der DNA-Lösung. The neocortex is the phylogenetically youngest part of the mammalian brain and its formation during the embryonic period is a complexly regulated process that depends on intrinsic and extrinsic influencing factors. In the course of the last decades, the discovery of the endocannabinoid system has also shed light on its importance for the development of the brain in general and the neocortex in particular. The endocannabinoid system is a retrogradely acting neurotransmitter system that is present almost throughout the brain and consists of the endocannabinoids, mainly Anandamide (AE) and 2-Arachidonoylglycerol (2-AG), their building and degrading enzymes and its receptors, cannabinoid receptor 1 (CB1) and cannabinoid receptor 2 (CB2). While the endocannabinoid system in the adult brain can have both inhibitory and excitatory effects by inhibiting excitatory or inhibitory afferents, thereby ensuring neuroexcitatory balance, in the embryonic phase it fulfils many important tasks during the development of the brain differing from those in the adult brain: In addition to its influence on the cell division rate and the migration of developing neurons, the formation of cell processes and their branching is also regulated by the endocannabinoid system. However, the effects of reduced AEA levels have so far only been studied in vitro. However, since corticogenesis is a three-dimensional process influenced by various environmental factors, the study of these processes in vivo is of relevance. In recent years, the technique of in utero electroporation has become increasingly accepted and has recently been optimised for the well-studied mouse line C57BL/6. With the help of this technique, changes can be made to embryos in vivo by introducing genetic material from the outside and introducing it into cells of the target tissue by electroporation. Subsequently, further physiological embryonic development can proceed and finally, the effects of the modifications can be studied at any point in time. In this work, two plasmids suitable for use in the context of in utero electroporation were constructed to lead to overexpression of the AEA-degrading enzyme FAAH in target cells. The established eukaryotic expression vector pCAGIG, which in addition to the strong CAG promoter has an internal ribosomal entry site (IRES) and the reporter gene GFP, served as a template vector. The FAAH sequence was cloned into this vector together with an HA-tag from a viral expression vector and the proper function of the resulting construct was verified. In addition, a second vector was generated which, with the help of a floxed stop, should enable a Cre recombinase-dependent and thus cell type-specific expression of FAAH. In addition, suitable techniques for the evaluation of transfected tissue were investigated. With the help of experiments in cell culture, the proper function of both vectors was demonstrated by fluorescence microscopy and protein detection methods. In the future, they can be used for the investigation of a decreased AEA concentration on the development of the neocortex. Since physiologically mainly glutamatergic projection neurons express FAAH, a combination of pCAGIG- floxstop-HA-FAAH with a NEX-Cre mouse, for example, would be of interest for the future. In the context of preparing transfected tissue, a frozen section thickness of 80 μm proved to be optimal, while preparing tissue before fixation led to better results than subsequent preparation. It was shown that immunohistochemical detection of the reporter gene GFP is preferable to pure fluorescence microscopic detection of native GFP for the identification of successfully transfected areas. Significant factors influencing transfection efficiency were the duration of the procedure, safe contact of the electrode forceps with the tissue to be electroporated and careful injection of the DNA solution.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6435
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-0eed1b0d-8510-4d45-b21d-437597a3246f4
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	130 Seiten, Illustrationen, Diagramme
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