Radiomarkierte Antikörperkonjugate für die Anwendung in der Immuno-PET und Radioimmuntherapie sowie Darstellung zielgerichteter, PET-visualisierbarer Wirkstofftransportsysteme
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Die Positronenemissionstomographie (PET) ist ein sensitives, nicht-invasives bildgebendes Verfahren zur frühzeitigen Diagnose und Visualisierung therapeutischer Verläufe insbesondere bei onkologischen aber auch neurologischen und anderen medizinischen Fragestellungen. Neben der bildgebenden Nutzung radioaktiver Strahlung ermöglicht die Verwendung Partikel-emittierender Nuklide im Rahmen der Radionuklid- oder Endoradiotherapie außerdem, malignes Gewebe gezielt und effektiv zu behandeln. Der Einsatz monoklonaler Antikörper (mAb) für therapeutische Zwecke ist einer der bedeutendsten und schnellst wachsenden Bereiche der modernen Medizin. Neben ihrer eigenen therapeutischen oder präventiven Wirkung bieten diese hochspezifischen Immunproteine zudem die Möglichkeit, diagnostisch oder therapeutisch relevante Radionuklide zu bestimmten, beispielsweise tumorassoziierten Zielstrukturen zu transportieren und sie somit für die sogenannte Immuno-PET Bildgebung oder Radioimmuntherapie (RIT) zu nutzen. Viele konventionelle Krebstherapeutika besitzen typischerweise eine geringe Bioverfügbarkeit, unzureichende Spezifität und hohe systemische Toxizität. Durch deren Einschluss in Wirkstofftransportsysteme wie z. B. Liposome können Zirkulationszeiten und die selektive Anreicherung im Zielgewebe jedoch signifikant erhöht und somit notwendige Mengen reduziert und Nebenwirkungen vermieden werden. Die zusätzliche Markierung dieser Systeme mit einem Positron-emittierenden Radionuklid ermöglicht zudem deren Visualisierung und Evaluierung in vivo mittels PET. Auf Basis dieser Grundlagen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige Antikörperkonjugate für die Immuno-PET oder Radioimmuntherapie entwickelt, synthetisiert, unter Verwendung der Radionuklide 89Zr oder 177Lu radiomarkiert sowie in vitro und in vivo evaluiert. Im ersten Teil der Arbeit konnte der DFO-funktionalisierte, 89Zr-markierte monoklonale Antikörper Muromonab-CD3 erfolgreich dazu verwendet werden, die Migration CD3-positiver T-Zellen bei der Entwicklung einer Spender-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD) innerhalb eines humanisierten Mausmodells mittels Immuno-PET/MRT zu visualisieren. Bereits in frühen Stadien der Erkrankung wurde dabei eine hohe Infiltration humaner T-Zellen bzw. Akkumulation des Radioimmunkonjugats in Milz, Leber und Darm beobachtet. Insbesondere die Leber zeigte eine krankheitsbedingte und zeitlich ansteigende, heterogene Anreicherung der Aktivität in Form „inflammatorischer Hotspots“. Außerdem konnte eine eindeutige Reduktion der T-Zellen in GvHD-relevanten Organen durch den präventiven Einfluss zusätzlich verabreichter regulatorischer T-Zellen dargestellt werden. Insgesamt zeigte sich eine starke Korrelation der erhaltenen PET/MRT-Aufnahmen mit der klinischen Symptomatik sowie den Ergebnissen von ex vivo-Analysen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung und in vitro-Evaluierung innovativer, bifunktioneller Chelatorderivate auf Basis des hybriden 6-Amino-1,4-diazepan Grundgerüsts in Kombination mit Hydroxamat-tragenden Seitenketten für die stabile Komplexierung von 89Zr. Neben der als Hy3ADA5 bezeichneten Grundstruktur konnten zwei weitere, p-Isothiocyanatophenyl- bzw. Quadratsäureamid (SA)-funktionalisierte Derivate erfolgreich synthetisiert, an den Antikörper Bevacizumab gebunden und radiochemisch untersucht werden. Sowohl in freier, ungebundener Form als auch konjugiert an den Modellantikörper zeigten die neuen Chelatorderivate eine schnelle und effektive 89Zr-Markierung unter milden Bedingungen (82–94 % RCU) sowie ausgezeichnete in vitro-Komplexstabilitäten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und humanem Serum (< 3 % Dissoziation). Analog funktionalisierte, konjugierte und untersuchte Referenzsysteme auf Basis von DFO und des erweiterten DFO* lieferten eine leicht schnellere 89Zr-Markierungskinetik sowie ähnlich hohe in vitro-Stabilitäten. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein Quadratsäureamid-Derivat des Hybridchelators AAZTA5 synthetisiert und hinsichtlich seines Potentials für die 177Lu-Markierung monoklonaler Antikörper für zukünftige radioimmuntherapeutische Anwendungen evaluiert. Als Vergleich dienten analog funktionalisierte und radiochemisch untersuchte Derivate des zyklischen DOTA sowie der linearen Chelatoren DTPA und CHX-A″-DTPA. Gebunden an den Modellantikörper Bevacizumab zeigte AAZTA5-SA bei milden Bedingungen ausgezeichnete 177Lu-Markierungseigenschaften mit einem radiochemischen Umsatz von 85–90 % schon nach 10–15 min sowie einer nahezu quantitativen Komplexierung nach 30 min. Während für DOTA-SA-mAb nur eine vernachlässigbar geringe 177Lu-Markierung (< 2 % RCU) beobachtet wurde, zeigte das DTPA-funktionalisierte Analogon sogar eine noch schnellere Komplexierungskinetik. CHX-A″-DTPA-SA-mAb lieferte eine zwar ebenfalls sehr schnelle aber unvollständige Inkorporation des Radiometalls. Ähnlich wie auch beide DTPA-basierten Systeme zeigte [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-mAb sowohl in PBS als auch in humanem Serum über einen Zeitraum von 15 Tagen eine sehr hohe Komplexstabilität von > 92 % bzw. > 94 % Protein-gebundener Aktivität. Auf Basis dieser vielversprechenden Ergebnisse diente der bifunktionelle Chelator AAZTA5-SA anschließend zur 177Lu-Markierung des monoklonalen Antikörpers GGSK-1/30, welcher spezifisch an humanes tumorassoziiertes Mucin1 (hu(TA)MUC1) bindet. Zur Evaluierung seines Potentials für die RIT von hu(TA)MUC1-exprimierendem Brustkrebs wurden die Bindungseigenschaften des resultierenden Radioimmunkonjugats in vitro und in tumortragenden Mäusen untersucht. [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-GGSK-1/30 zeigte in vitro mit einem Anteil von max. 34–38 % gebundener Aktivität eine deutliche Affinität zu hu(TA)MUC1-exprimierenden PyMTxhuMUC1- und T47D-Zellen. Anhand ex vivo-Biodistributionsstudien konnte mit > 40 %ID/g und > 80 %ID/g nach 24 h bzw. 7 Tagen eine ausgesprochen hohe und weiter zunehmende Akkumulation des 177Lu-markierten Antikörpers in PyMTxMUC1-Tumoren beobachtet werden. Die signifikant geringere Anreicherung in Tumorgewebe ohne Antigen-Expression bestätigte die hohe Spezifität des Immunkonjugats. Abgesehen vom Uptake der Leber und der Lymphknoten konnte insgesamt eine sehr geringe unspezifische Anreicherung (< 9 %ID/g) in anderem Nicht-Ziel-Gewebe wie Lunge, Herz, Pankreas, Magen, Nieren, Milz und Knochen beobachtet werden. Im abschließenden Teilprojekt dieser Arbeit wurden außerdem PSMA-spezifische, PET-visualisierbare „Stealth“-Liposome für den potentiellen zielgerichteten Wirkstofftransport bei der Behandlung von Prostatakrebs hergestellt und charakterisiert. Hierfür erfolgte zunächst die Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) zwischen einem Azid-tragenden, Quadratsäure-gekoppelten Derivat des PSMA-spezifischen KuE und einem Alkin-funktionalisierten Polyetherlipid, bestehend aus hyperverzweigtem Polyglycerol (hbPG) und zwei hydrophoben Alkylketten. Durch eine zweite CuAAC wurde das Polyetherlipid anschließend mit dem zuvor radiofluorierten Click-Synthon [18F]F-TEG-N3 indirekt mit 18F markiert. Unter Zusatz des Phospholipids DOPC und Cholesterin als strukturgebende bzw. stabilisierende Komponenten wurden schließlich KuE-SA-tragende, 18F-markierte und hbPG-abgeschirmte Liposome mittels Dünnfilm-Hydration und wiederholter Extrusion hergestellt. Mit einem per DLS ermittelten Durchmesser von 199 nm liegt die Größe der erhaltenen Partikel im angestrebten Bereich von 100–200 nm und erfüllt somit die Anforderungen für eine lange Zirkulationszeit und effektive Tumoranreicherung.