Authors:	Klasen, Benedikt
Title:	Radiomarkierte Antikörperkonjugate für die Anwendung in der Immuno-PET und Radioimmuntherapie sowie Darstellung zielgerichteter, PET-visualisierbarer Wirkstofftransportsysteme
Online publication date:	15-Oct-2021
Year of first publication:	2021
Language:	german
Abstract:	Die Positronenemissionstomographie (PET) ist ein sensitives, nicht-invasives bildgebendes Verfahren zur frühzeitigen Diagnose und Visualisierung therapeutischer Verläufe insbesondere bei onkologischen aber auch neurologischen und anderen medizinischen Fragestellungen. Neben der bildgebenden Nutzung radioaktiver Strahlung ermöglicht die Verwendung Partikel-emittierender Nuklide im Rahmen der Radionuklid- oder Endoradiotherapie außerdem, malignes Gewebe gezielt und effektiv zu behandeln. Der Einsatz monoklonaler Antikörper (mAb) für therapeutische Zwecke ist einer der bedeutendsten und schnellst wachsenden Bereiche der modernen Medizin. Neben ihrer eigenen therapeutischen oder präventiven Wirkung bieten diese hochspezifischen Immunproteine zudem die Möglichkeit, diagnostisch oder therapeutisch relevante Radionuklide zu bestimmten, beispielsweise tumorassoziierten Zielstrukturen zu transportieren und sie somit für die sogenannte Immuno-PET Bildgebung oder Radioimmuntherapie (RIT) zu nutzen. Viele konventionelle Krebstherapeutika besitzen typischerweise eine geringe Bioverfügbarkeit, unzureichende Spezifität und hohe systemische Toxizität. Durch deren Einschluss in Wirkstofftransportsysteme wie z. B. Liposome können Zirkulationszeiten und die selektive Anreicherung im Zielgewebe jedoch signifikant erhöht und somit notwendige Mengen reduziert und Nebenwirkungen vermieden werden. Die zusätzliche Markierung dieser Systeme mit einem Positron-emittierenden Radionuklid ermöglicht zudem deren Visualisierung und Evaluierung in vivo mittels PET. Auf Basis dieser Grundlagen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige Antikörperkonjugate für die Immuno-PET oder Radioimmuntherapie entwickelt, synthetisiert, unter Verwendung der Radionuklide 89Zr oder 177Lu radiomarkiert sowie in vitro und in vivo evaluiert. Im ersten Teil der Arbeit konnte der DFO-funktionalisierte, 89Zr-markierte monoklonale Antikörper Muromonab-CD3 erfolgreich dazu verwendet werden, die Migration CD3-positiver T-Zellen bei der Entwicklung einer Spender-gegen-Empfänger-Reaktion (GvHD) innerhalb eines humanisierten Mausmodells mittels Immuno-PET/MRT zu visualisieren. Bereits in frühen Stadien der Erkrankung wurde dabei eine hohe Infiltration humaner T-Zellen bzw. Akkumulation des Radioimmunkonjugats in Milz, Leber und Darm beobachtet. Insbesondere die Leber zeigte eine krankheitsbedingte und zeitlich ansteigende, heterogene Anreicherung der Aktivität in Form „inflammatorischer Hotspots“. Außerdem konnte eine eindeutige Reduktion der T-Zellen in GvHD-relevanten Organen durch den präventiven Einfluss zusätzlich verabreichter regulatorischer T-Zellen dargestellt werden. Insgesamt zeigte sich eine starke Korrelation der erhaltenen PET/MRT-Aufnahmen mit der klinischen Symptomatik sowie den Ergebnissen von ex vivo-Analysen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung und in vitro-Evaluierung innovativer, bifunktioneller Chelatorderivate auf Basis des hybriden 6-Amino-1,4-diazepan Grundgerüsts in Kombination mit Hydroxamat-tragenden Seitenketten für die stabile Komplexierung von 89Zr. Neben der als Hy3ADA5 bezeichneten Grundstruktur konnten zwei weitere, p-Isothiocyanatophenyl- bzw. Quadratsäureamid (SA)-funktionalisierte Derivate erfolgreich synthetisiert, an den Antikörper Bevacizumab gebunden und radiochemisch untersucht werden. Sowohl in freier, ungebundener Form als auch konjugiert an den Modellantikörper zeigten die neuen Chelatorderivate eine schnelle und effektive 89Zr-Markierung unter milden Bedingungen (82–94 % RCU) sowie ausgezeichnete in vitro-Komplexstabilitäten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und humanem Serum (< 3 % Dissoziation). Analog funktionalisierte, konjugierte und untersuchte Referenzsysteme auf Basis von DFO und des erweiterten DFO* lieferten eine leicht schnellere 89Zr-Markierungskinetik sowie ähnlich hohe in vitro-Stabilitäten. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein Quadratsäureamid-Derivat des Hybridchelators AAZTA5 synthetisiert und hinsichtlich seines Potentials für die 177Lu-Markierung monoklonaler Antikörper für zukünftige radioimmuntherapeutische Anwendungen evaluiert. Als Vergleich dienten analog funktionalisierte und radiochemisch untersuchte Derivate des zyklischen DOTA sowie der linearen Chelatoren DTPA und CHX-A″-DTPA. Gebunden an den Modellantikörper Bevacizumab zeigte AAZTA5-SA bei milden Bedingungen ausgezeichnete 177Lu-Markierungseigenschaften mit einem radiochemischen Umsatz von 85–90 % schon nach 10–15 min sowie einer nahezu quantitativen Komplexierung nach 30 min. Während für DOTA-SA-mAb nur eine vernachlässigbar geringe 177Lu-Markierung (< 2 % RCU) beobachtet wurde, zeigte das DTPA-funktionalisierte Analogon sogar eine noch schnellere Komplexierungskinetik. CHX-A″-DTPA-SA-mAb lieferte eine zwar ebenfalls sehr schnelle aber unvollständige Inkorporation des Radiometalls. Ähnlich wie auch beide DTPA-basierten Systeme zeigte [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-mAb sowohl in PBS als auch in humanem Serum über einen Zeitraum von 15 Tagen eine sehr hohe Komplexstabilität von > 92 % bzw. > 94 % Protein-gebundener Aktivität. Auf Basis dieser vielversprechenden Ergebnisse diente der bifunktionelle Chelator AAZTA5-SA anschließend zur 177Lu-Markierung des monoklonalen Antikörpers GGSK-1/30, welcher spezifisch an humanes tumorassoziiertes Mucin1 (hu(TA)MUC1) bindet. Zur Evaluierung seines Potentials für die RIT von hu(TA)MUC1-exprimierendem Brustkrebs wurden die Bindungseigenschaften des resultierenden Radioimmunkonjugats in vitro und in tumortragenden Mäusen untersucht. [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-GGSK-1/30 zeigte in vitro mit einem Anteil von max. 34–38 % gebundener Aktivität eine deutliche Affinität zu hu(TA)MUC1-exprimierenden PyMTxhuMUC1- und T47D-Zellen. Anhand ex vivo-Biodistributionsstudien konnte mit > 40 %ID/g und > 80 %ID/g nach 24 h bzw. 7 Tagen eine ausgesprochen hohe und weiter zunehmende Akkumulation des 177Lu-markierten Antikörpers in PyMTxMUC1-Tumoren beobachtet werden. Die signifikant geringere Anreicherung in Tumorgewebe ohne Antigen-Expression bestätigte die hohe Spezifität des Immunkonjugats. Abgesehen vom Uptake der Leber und der Lymphknoten konnte insgesamt eine sehr geringe unspezifische Anreicherung (< 9 %ID/g) in anderem Nicht-Ziel-Gewebe wie Lunge, Herz, Pankreas, Magen, Nieren, Milz und Knochen beobachtet werden. Im abschließenden Teilprojekt dieser Arbeit wurden außerdem PSMA-spezifische, PET-visualisierbare „Stealth“-Liposome für den potentiellen zielgerichteten Wirkstofftransport bei der Behandlung von Prostatakrebs hergestellt und charakterisiert. Hierfür erfolgte zunächst die Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) zwischen einem Azid-tragenden, Quadratsäure-gekoppelten Derivat des PSMA-spezifischen KuE und einem Alkin-funktionalisierten Polyetherlipid, bestehend aus hyperverzweigtem Polyglycerol (hbPG) und zwei hydrophoben Alkylketten. Durch eine zweite CuAAC wurde das Polyetherlipid anschließend mit dem zuvor radiofluorierten Click-Synthon [18F]F-TEG-N3 indirekt mit 18F markiert. Unter Zusatz des Phospholipids DOPC und Cholesterin als strukturgebende bzw. stabilisierende Komponenten wurden schließlich KuE-SA-tragende, 18F-markierte und hbPG-abgeschirmte Liposome mittels Dünnfilm-Hydration und wiederholter Extrusion hergestellt. Mit einem per DLS ermittelten Durchmesser von 199 nm liegt die Größe der erhaltenen Partikel im angestrebten Bereich von 100–200 nm und erfüllt somit die Anforderungen für eine lange Zirkulationszeit und effektive Tumoranreicherung. Positron emission tomography (PET) is a sensitive, non-invasive imaging technique for early diagnosis and visualization of therapeutic progress, particularly in oncological but also neurological and other medical issues. Beyond the diagnostic usage of radioactive radiation, the application of particle-emitting nuclides in the context of radionuclide or endoradiotherapy furthermore enables the specific and effective treatment of malignant tissue. Utilization of monoclonal antibodies (mAb) for therapeutic purposes is one of the most important and fastest growing areas of modern medicine. In addition to their own therapeutic or preventive effects, these highly specific immune proteins also offer the possibility of transporting diagnostically or therapeutically relevant radionuclides to specific, e.g. tumor-associated, target structures and thus being used for so-called immuno-PET imaging or radioimmunotherapy (RIT). Many conventional cancer therapeutics typically have low bioavailability, insufficient specificity and high systemic toxicity. However, by incorporating them in drug delivery systems such as liposomes, circulation times and selective accumulation in target tissues can be significantly increased, thereby reducing necessary doses and avoiding side effects. Furthermore, labeling of these systems with a positron-emitting radionuclide additionally enables their visualization and evaluation in vivo using PET. Based on these principles, novel antibody conjugates for immuno-PET or radioimmunotherapy were developed, synthesized, radiolabeled with 89Zr or 177Lu and evaluated in vitro as well as in vivo within the scope of this work. In the first part, the DFO-functionalized, 89Zr-labeled monoclonal antibody muromonab-CD3 was successfully used to visualize the migration of CD3-positive T cells during the development of graft-versus-host-disease (GvHD) in a humanized mouse model via immuno-PET/MRI. Already at early stages of the disease, a high accumulation of the radioimmunoconjugate, i.e. massive infiltration of human T cells in spleen, liver and intestine was observed. In particular, the liver exhibited a disease-related and temporally increasing heterogeneous accumulation of activity manifested as "inflammatory hotspots". Furthermore, a clear reduction of T cells in GvHD-relevant organs due to the preventive influence of additionally administered regulatory T cells could be depicted. Overall, there was a strong correlation of the obtained PET/MRI images with the clinical symptoms as well as the results of ex vivo analyses. The second part of the work focused on the development and in vitro evaluation of innovative, bifunctional chelator derivatives based on the hybrid 6-amino-1,4-diazepane backbone in combination with hydroxamate-bearing side chains for stable complexation of 89Zr. In addition to the basic structure named Hy3ADA5, two further derivatives, either p-isothiocyanatophenyl- or squaramide (SA)-functionalized, were successfully synthesized, coupled to the antibody bevacizumab and investigated radiochemically. Both stand-alone and conjugated to the model antibody, the new chelator derivatives showed fast and high yielding 89Zr-labeling under mild conditions (82–94% RCC) as well as excellent in vitro complex stabilities in phosphate-buffered saline (PBS) and human serum (< 3% dissociation). Analogously functionalized, conjugated and investigated reference systems based on DFO and the extended DFO* revealed slightly faster 89Zr-labeling kinetics as well as similarly high in vitro stabilities. In a further subproject, a squaramide derivative of the hybrid chelator AAZTA5 was synthesized and evaluated regarding its potential for 177Lu-labeling of monoclonal antibodies towards future radioimmunotherapeutic applications. Analogously functionalized and radiochemically investigated derivatives of cyclic DOTA as well as of the linear chelators DTPA and CHX-A″-DTPA served as references. Coupled to the model antibody bevacizumab, AAZTA5-SA showed excellent 177Lu-labeling properties under mild conditions with a radiochemical conversion of 85–90% already after 10–15 min as well as almost quantitative complexation after 30 min. While only negligible 177Lu-labeling (< 2% RCC) was observed using DOTA-SA-mAb, the DTPA-functionalized analogue showed even faster complexation kinetics. CHX-A″-DTPA-SA-mAb provided a likewise very rapid but incomplete incorporation of the radiometal. Similar to both DTPA-based systems, [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-mAb showed very high complex stability both in PBS and human serum with > 92% and > 94% protein-bound activity, respectively, over a period of 15 days. Based on these promising results, the bifunctional chelator AAZTA5-SA was subsequently used for 177Lu-labeling of the monoclonal antibody GGSK-1/30, which specifically binds to human tumor-associated mucin1 (hu(TA)MUC1). To evaluate its potential for RIT of hu(TA)MUC1 expressing breast cancer, the binding properties of the resulting radioimmunoconjugate were investigated in vitro and in tumor-bearing mice. [177Lu]Lu-AAZTA5-SA-GGSK-1/30 showed distinct affinity to hu(TA)MUC1 expressing PyMTxhuMUC1 and T47D cells in vitro with a maximum of 34–38% bound activity. By means of ex vivo biodistribution studies, an extraordinarily high and further increasing accumulation of the 177Lu-labeled antibody in PyMTxMUC1 tumors was observed with > 40% ID/g and > 80% ID/g after 24 h and 7 days, respectively. The significantly lower accumulation in tumor tissues without antigen expression confirmed the high specificity of the immunoconjugate. Except for liver and lymph node uptake, an overall very low unspecific enrichment (< 9% ID/g) was observed in other non-target tissues such as lung, heart, pancreas, stomach, kidney, spleen, and bones. Furthermore, in the final subproject of this work, PSMA-specific, PET-traceable "stealth" liposomes for potential targeted drug delivery in the treatment of prostate cancer were prepared and characterized. For this purpose, the first step included a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) between an azide-bearing, squaric acid-coupled derivative of PSMA-specific KuE and an alkyne-functionalized polyether lipid consisting of hyperbranched polyglycerol (hbPG) and two hydrophobic alkyl chains. Subsequently, a second CuAAC was applied for indirect 18F-labeling of the polyether lipid using the previously radiofluorinated click-synthon [18F]F-TEG-N3. After addition of the phospholipid DOPC and cholesterol as structure-defining and stabilizing components, finally KuE-SA-bearing, 18F-labeled and hbPG-shielded liposomes were prepared via thin-film hydration and repeated extrusion. With a diameter of 199 nm as determined via DLS, the size of the obtained particles is within the intended range of 100–200 nm, thus meeting the requirements for long circulation time and effective tumor accumulation.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch. Sonderforschungsbereiche (SFB)
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6386
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-65ccd1c8-f163-48e4-9366-d44c35941f242
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-ND
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/
Extent:	302 Seiten, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen