A comprehensive analysis of the DNA damage response by mass spectrometry-based proteomics
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Das menschliche Genom ist ununterbrochen DNA-schädigenden Quellen ausgesetzt. Um die Stabilität des Genoms aufrechtzuerhalten, nutzen eukaryotische Zellen die Schutzmechanismen der DNA-Schadensreaktion (engl. DDR), die ein breites Spektrum an Signal- und Reparaturwegen umfassen. Diese werden durch dynamische Veränderungen von posttranslationalen Modifikationen (PTMs) koordiniert, unter denen Phosphorylierung und Ubiquitinierung eine zentrale Rolle spielen. Obwohl intensiv an der DDR geforscht wird, fehlt es an Studien, die systematisch die zelluläre Antwort auf verschiedene Arten von DNA-Schäden untersuchen und vergleichen.
Zu diesem Zweck haben wir einen reproduzierbaren und effizienten Arbeitsablauf für Multiplex-Proteom- und PTM-Analysen mittels Massenspektrometrie etabliert. Dies hat es uns gestattet, die zellulären Antworten auf 11 verschiedene DNA-schädigende Substanzen zu untersuchen, und führte mit knapp 450.000 Datenpunkten zu einem der größten proteomischen Datensätze über die DDR. Insgesamt haben wir Daten zu fast 8.500 Proteinen, 24.000 Phosphopeptiden, 2.200 Diglycin-Lysin (diGly)-modifizierten Peptiden und 6.400 Chromatin-assoziierten Proteinen für die einzelnen Behandlungsbedingungen zusammengestellt. Diese haben es uns ermöglicht, gemeine von behandlungsspezifischen Effekten zu unterscheiden und Proteinmodifikation mit Proteinlokalisierung zu verknüpfen. Weiterhin haben wir die DNA Damage Response dataBase (DDRBase) erstellt, die der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen einfachen Zugang zu diesen Daten bietet.
Basierend auf unserer Datenbank haben wir die HECT-Typ E3-Ubiquitin-Ligase UBE3A (auch bekannt als E6AP) als einen neuen Faktor in der DDR identifiziert. Der Verlust von UBE3A behindert die Signalisierung von DNA-Schäden, reduziert die Reparatur von Doppelstrangbrüchen, führt zu Instabilität des Genoms und induziert Zellzyklusarrest. Des Weiteren zeigen wir, dass UBE3A als Reaktion auf DNA-Schäden von den Kinase ATM und ATR an Serin 218 phosphoryliert wird, was die Translokation von UBE3A in den Nukleus zur Folge hat. Die Unterdrückung der Phosphorylierung hemmt die Translokation und sensibilisiert die Zellen für genotoxischen Stress. Zusätzlich wird die Ubiquitinierungsaktivität von UBE3A durch die Induktion von DNA-Schäden verringert.
Mittels Interaktom- und DiGly-Restanalyse haben wir mehrere mutmaßliche UBE3A-Interaktoren und/oder -Substrate identifiziert, die eine starke Verbindung von UBE3A zum Proteasom und der DNA-Replikationsmaschinerie aufzeigen. In Übereinstimmung hiermit haben unsere Untersuchungen die katalytische Untereinheit von POLδ (POLD1) als neues UBE3A-Substrat verifiziert und UBE3A als Regulator der Proteasom-Aktivität impliziert. Wir haben herausgefunden, dass Hydroxyharnstoff die Interaktion von UBE3A mit dem Proteasom stört, was mit einer verminderten Ubiquitinierung des Proteasomrezeptors RPN10 und einer erhöhten katalytischen Aktivität des Proteasoms einhergeht.
Abschließend hoffen wir, dass unsere DDRBase zu einer wertvollen Ressource für die Forscher der DDR wird, die die Extraktion von protein-spezifischen Informationen, den einfachen Vergleich zwischen verschiedenen Behandlungsbedingungen und die Identifizierung neuartiger Reparaturfaktoren, wie am Beispiel von UBE3A gezeigt, ermöglicht.