Authors:	Ostermaier, Matthias
Title:	A comprehensive analysis of the DNA damage response by mass spectrometry-based proteomics
Online publication date:	8-Mar-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	Das menschliche Genom ist ununterbrochen DNA-schädigenden Quellen ausgesetzt. Um die Stabilität des Genoms aufrechtzuerhalten, nutzen eukaryotische Zellen die Schutzmechanismen der DNA-Schadensreaktion (engl. DDR), die ein breites Spektrum an Signal- und Reparaturwegen umfassen. Diese werden durch dynamische Veränderungen von posttranslationalen Modifikationen (PTMs) koordiniert, unter denen Phosphorylierung und Ubiquitinierung eine zentrale Rolle spielen. Obwohl intensiv an der DDR geforscht wird, fehlt es an Studien, die systematisch die zelluläre Antwort auf verschiedene Arten von DNA-Schäden untersuchen und vergleichen. Zu diesem Zweck haben wir einen reproduzierbaren und effizienten Arbeitsablauf für Multiplex-Proteom- und PTM-Analysen mittels Massenspektrometrie etabliert. Dies hat es uns gestattet, die zellulären Antworten auf 11 verschiedene DNA-schädigende Substanzen zu untersuchen, und führte mit knapp 450.000 Datenpunkten zu einem der größten proteomischen Datensätze über die DDR. Insgesamt haben wir Daten zu fast 8.500 Proteinen, 24.000 Phosphopeptiden, 2.200 Diglycin-Lysin (diGly)-modifizierten Peptiden und 6.400 Chromatin-assoziierten Proteinen für die einzelnen Behandlungsbedingungen zusammengestellt. Diese haben es uns ermöglicht, gemeine von behandlungsspezifischen Effekten zu unterscheiden und Proteinmodifikation mit Proteinlokalisierung zu verknüpfen. Weiterhin haben wir die DNA Damage Response dataBase (DDRBase) erstellt, die der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen einfachen Zugang zu diesen Daten bietet. Basierend auf unserer Datenbank haben wir die HECT-Typ E3-Ubiquitin-Ligase UBE3A (auch bekannt als E6AP) als einen neuen Faktor in der DDR identifiziert. Der Verlust von UBE3A behindert die Signalisierung von DNA-Schäden, reduziert die Reparatur von Doppelstrangbrüchen, führt zu Instabilität des Genoms und induziert Zellzyklusarrest. Des Weiteren zeigen wir, dass UBE3A als Reaktion auf DNA-Schäden von den Kinase ATM und ATR an Serin 218 phosphoryliert wird, was die Translokation von UBE3A in den Nukleus zur Folge hat. Die Unterdrückung der Phosphorylierung hemmt die Translokation und sensibilisiert die Zellen für genotoxischen Stress. Zusätzlich wird die Ubiquitinierungsaktivität von UBE3A durch die Induktion von DNA-Schäden verringert. Mittels Interaktom- und DiGly-Restanalyse haben wir mehrere mutmaßliche UBE3A-Interaktoren und/oder -Substrate identifiziert, die eine starke Verbindung von UBE3A zum Proteasom und der DNA-Replikationsmaschinerie aufzeigen. In Übereinstimmung hiermit haben unsere Untersuchungen die katalytische Untereinheit von POLδ (POLD1) als neues UBE3A-Substrat verifiziert und UBE3A als Regulator der Proteasom-Aktivität impliziert. Wir haben herausgefunden, dass Hydroxyharnstoff die Interaktion von UBE3A mit dem Proteasom stört, was mit einer verminderten Ubiquitinierung des Proteasomrezeptors RPN10 und einer erhöhten katalytischen Aktivität des Proteasoms einhergeht. Abschließend hoffen wir, dass unsere DDRBase zu einer wertvollen Ressource für die Forscher der DDR wird, die die Extraktion von protein-spezifischen Informationen, den einfachen Vergleich zwischen verschiedenen Behandlungsbedingungen und die Identifizierung neuartiger Reparaturfaktoren, wie am Beispiel von UBE3A gezeigt, ermöglicht. The integrity of the human genome is continuously challenged by external agents and endogenous sources. To maintain genome stability, eukaryotic cells utilize protective mechanisms of the DNA damage response (DDR), which encompass a wide range of signaling and repair pathways. These are coordinated by dynamic changes in posttranslational modifications (PTMs), among which phosphorylation and ubiquitination play a central role. Although the DDR has been intensively investigated, a comprehensive analysis systematically comparing the cellular responses to different types of DNA damage is still lacking. To this end, we established a reproducible and efficient workflow for multiplexed proteome and PTM analyses by mass spectrometry. This permitted to investigate cellular responses to 11 different DNA damage-inducing agents, resulting in one of the largest proteomic datasets on the DDR with ~450,000 data points. These included curated information on nearly 8,500 proteins, 24,000 phosphopeptides, 2,200 diglycine-lysine (diGly)-modified peptides, and 6,400 chromatin-associated proteins for each of the treatment conditions. Our data enabled to distinguish common from treatment-specific effects and linked protein modification to protein localization. Finally, we have created the DNA Damage Response dataBase (DDRBase), which provides easy access to these data to the scientific community. Based on the proteomic screens, we identified a role of the HECT-type E3 ubiquitin ligase UBE3A (also known as E6AP) in the DDR. Loss of UBE3A negatively influenced DNA damage signaling, reduced double-strand break repair, led to genomic instability, and induced cell cycle arrest. We further showed that ATM and ATR phosphorylate UBE3A on serine 218, which mediates its nuclear translocation in response to DNA damage. Disruption of UBE3A phosphorylation inhibited its translocation and sensitized cells to genotoxic stress. Additionally, the ubiquitination activity of UBE3A was reduced in response to DNA damage. By interactome and DiGly remnant analysis, we identified several putative UBE3A interactors and/or substrates, revealing a connection of UBE3A with the proteasome and the DNA replication machinery. In line with this, we verified the catalytic subunit of POLδ (POLD1) as a UBE3A substrate and implicated UBE3A in the regulation of proteasome activity. We found that hydroxyurea disrupted the interaction of UBE3A with the proteasome, which was associated with decreased ubiquitination of the proteasome receptor RPN10, and increased catalytic activity of the proteasome. Ultimately, we hope that our DDRBase will become a valuable resource for the DNA damage community that allows extraction of protein-specific information, easy comparison between different treatment conditions, and the identification of novel repair factors, as exemplified for UBE3A.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6271
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-fa448777-7a98-4f5c-bcf2-75bab12e7eb74
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XI, 143 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen