Authors:	Penner, Inessa
Title:	The impact of a human cytomegalovirus subviral particle vaccine on the host cell proteome and on virus replication
Online publication date:	17-Aug-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	The development of a vaccine against the human cytomegalovirus (HCMV), suitable to prevent congenital disease in neonates and to reduce morbidity and mortality in immunocompromised patients has been ranked as a top-priority medical goal. Non-infectious HCMV particles, termed Dense Bodies (DBs) are a promising platform to develop such a vaccine. The particles are a unique product of cytomegalovirus infected cells and are concomitantly released with infectious virions. Purified DBs are highly immunogenic in laboratory animals, as they elicit both neutralizing antibodies as well as antiviral T lymphocytes. A DB-based vaccine has, however, not yet been tested in humans. In preparation of clinical studies, this project was designed to investigate the molecular interactions of DBs with different target cells and to study the impact of DBs on HCMV replication. Proteomic analyses were performed on different culture cells, like fibroblasts or endothelial cells that were exposed to DBs. A striking result of this was that exposure of cells to DBs resulted in the upregulation of an array of interferon (IFN) regulated genes (IRGs), likely leading to the establishment of an antiviral state in these cells. The inhibition of the IFN JAK/STAT signalling cascade during DB incubation demonstrated that upregulation of IRGs like MX1, IFIT3 and ISG15 was dependent on type I IFN signalling. Another remarkable finding was that DBs also promoted the upregulation of components of the major histocompatibility complex (MHC) antigen presentation pathways and connected cellular processes, namely ubiquitination and autophagy. This adds significantly to our understanding about the particular feature of DBs to efficiently induce antiviral CD4- and CD8- T lymphocytes in the absence of viral gene expression. Besides this, proteins involved in other biological processes like cell-cycle regulation and chromosome organisation were upregulated in fibroblasts and endothelial cells, but also in haematopoietic cells like monocytes and dendritic cells (DCs), showing the complex pattern of cellular protein regulation following DB-exposure. As a DB-vaccine would be applied to millions of individuals, part of whom would be latently infected, a second prompting question was, if these particles would support or restrict HCMV replication. Enhancement of viral replication would be an adverse function of these particles that likely would prevent vaccine licensing. Exposure of fibroblasts to DBs however indeed reduced HCMV progeny production. The effect was most prominent when the cells were “primed” by DBs prior to infection. This fosters the hypothesis that DBs are produced by cells as an antiviral mechanism, similar to IFNs that induce an antiviral state in neighbouring cells and thus protects them against subsequent HCMV infection. This work provides the basis to further test this hypothesis. Die Entwicklung eines Impfstoffs gegen das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist von hoher medizinischer Relevanz. Im Vordergrund stehen dabei die Prävention der kongenitalen HCMV-Infektion und die Reduktion der HCMV-bedingten Krankheitslast bei immunsupprimierten Patienten. Nicht-infektiöse HCMV-Partikel, so genannte Dense Bodies (DBs) sind eine vielversprechende Plattform zur Entwicklung eines solchen Impfstoffs. Die Partikel werden von infizierten Zellen gebildet und zusammen mit infektiösen Virionen freigesetzt. Gereinigte DBs erwiesen sich im Tierversuch als hoch immunogen, sie waren geeignet sowohl neutralisierende Antikörper als auch antivirale T-Lymphozyten zu induzieren. Ein DB-basierter Impfstoff wurde jedoch noch nicht am Menschen getestet. In Vorbereitung auf klinische Studien wurden in diesem Projekt die molekularen Interaktionen von DBs mit verschiedenen Zielzellen untersucht. In einem weiteren Schritt wurde der Einfluss von DBs auf die HCMV Vermehrung analysiert. Mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden in einem ersten Schritt DB-induzierte Veränderungen am Proteom von unterschiedlichen Zellkulturen, wie Fibroblastenkulturen oder Endothelzellkulturen analysiert. Ein spannendes Ergebnis war, dass die DB-Exposition zur deutlichen Steigerung der Expression von Interferon-(IFN)-regulierten Genen (IRGs) führte. Die Expression von IRGs ist ein zellulärer Abwehrmechanismus gegen Virusinfektion. Die Ergebnisse legen daher nahe, dass DBs zur Etablierung eines antiviralen Zustands in den Zellen führen. Die Hemmung der IFN-JAK/STAT-Signalkaskade während der DB-Inkubation hemmte auch die Induktion der IRGs MX1, IFIT3 und ISG15. Dies zeigte, dass die DB-vermittelte IRG-Induktion über die Typ-I-IFN-abhängige Signaltransduktion vermittelt wird. Ein weiterer bemerkenswerter Befund war, dass DBs Komponenten der MHC Klasse I und MHC Klasse II vermittelten Antigenpräsentation, sowie Proteine der Ubiquitin-vermittelten Proteindegradation und der Autophagie induzierten. Diese Befunde tragen wesentlich zu unserem Verständnis der außergewöhnlichen, immunogenen Eigenschaften von DBs bei, die antivirale CD4- und CD8-T-Lymphozyten in Abwesenheit viraler Genexpression effizient zu induzieren. Daneben fanden sich Proteine der Zellzyklusregulation und der Chromosomenorganisation in Fibroblasten und Endothelzellen, aber auch in hämatopoetischen Zellen wie Monozyten und dendritischen Zellen verstärkt exprimiert. Diese Analysen zeigten somit ein bemerkenswert komplexes Muster der zellulären Proteinregulation nach DB-Exposition auf. Da ein DB-Impfstoff prospektiv Millionen von Menschen appliziert wird, von denen ein Teil latent HCMV-infiziert ist, war eine zweite Fragestellung, ob diese Partikel die HCMV-Vermehrung unterstützen oder reprimieren würden. Eine Verstärkung der viralen Replikation wäre eine nachteilige Funktion dieser Partikel, die wahrscheinlich die Zulassung des Impfstoffs behindern würde. Die Exposition von Fibroblasten gegenüber DBs reduzierte jedoch tatsächlich die Produktion von HCMV Tochterviren. Der Effekt war am deutlichsten, wenn die Zellen vor der Infektion mit DBs vor-inkubiert wurden. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass DBs von Zellen als antiviraler Mechanismus produziert werden um, ähnlich wie IFN, einen antiviralen Zustand in benachbarten Zellen zu induzieren und sie so vor einer nachfolgenden HCMV-Infektion zu schützen. Diese Arbeit bietet die Grundlage, um diese Hypothese weiter zu testen. Zusammengefasst unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die potenziellen antiviralen Funktionen von DBs. Sie beschreiben wichtige Mechanismen zur Wirkung dieser Partikel und liefern damit maßgebliche Argumente für die Beantragung erster klinischer Studien mit einem DB-Impfstoff.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6269
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-487339cf-e08c-4b27-83be-2115cb5981ab2
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VIII, 156 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen