Authors:	Wu, Yingke
Advisor:	Weil, Tanja
Title:	Surface Modification of Nanodiamonds for Bioapplication
Online publication date:	20-Jul-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	Cancer is one of the major serious health problems and burdens in both developed and developing countries. To alleviate the situation, it is essential to develop sensitive detectors for early diagnosis and more advanced methods to monitor and treat patients. nanodiamonds (NDs) are a unique carbon-based nanomaterial due to its outstanding optical and magnetic properties as well as excellent biocompatibility. It has attracted a lot of attention from scientists. The optically active atom defects in NDs, for example, the Nitrogen Vacancy (NV) center, endow stable fluorescence without photoblinking and photobleaching. It resulted in NDs have been widely applied in bioimaging and real-time reporters for drug delivery. In addition, NDs containing negatively charged NV (NV⁻) centers can serve as single-spin sensors to detect critical physical parameters in a biological microenvironment, such as temperature, magnetic fields, electron spins, and mechanical strain. For most of these applications, stable and appropriate functionalized nanodiamonds (NDs) are required. As the colloidal stability of unmodified NDs is very poor in solution, the aggregation of NDs becomes dramatically amplified when the size of the diamond decreases to the nanoscale. In addition, surface functionalization improves the surface flatness, which is often the starting point for further attachment of other motifs such as drug molecules, dyes, targeting groups or antibodies. Importantly, a uniform particle surface increases the amount of binding sites and reproducibility. Furthermore, surface coating is very valuable in vivo to avoid foreign body interactions toward the particles and help the nanoparticles to accumulate and remain at the target sites for a prolonged time period. In this thesis, two novel nature-inspired coating materials are explored to optimize the surface properties of NDs firstly. The first coating material is poly(L-DOPA), which is obtained by the self-polymerization of the neurotransmitter L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) inspired from “protein glue” of mussel foot proteins. The polymerization of L-DOPA provides a highly crosslinked polymer with reactive surface functional groups including amines, carboxylic acids, alcohols, and conjugated Michael acceptors. Herein, L-DOPA is polymerized on NDs with a high control over the shell thickness. Subsequently, conjugation of transferrin to provide efficient receptor specific cellular transport, improves the colloidal stability and cellular uptake of the poly(L-DOPA)-coated NDs. The loading of the FDA-approved photothermal drug indocyanine green (ICG) yields an integrated biohybrid nanomaterial exhibiting an amplified photothermal effect in cells at very low energy intake (~90 mW/cm2). Viruses are evolutionary optimized carrier systems and have been applied for cell invasion. They have gained great interest in recent years as tools to boost the cell uptake. The second coating material is a capsid protein (CP) from Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV). CP was first isolated from the CCMV, which is subsequently used to prepare highly stable virus capsid protein encapsulated NDs (ND-CP). A thin layer of protein coating is obtained surrounding the NDs, imparting reactive groups as well as high colloidal stability. It doesn’t affect the physical properties of NDs. In addition, the ND-CP shows good cellular uptake and excellent biocompatibility both in vitro and in vivo. Furthermore, the long-term intracellular trafficking has been investigated by the ND-CP owning to the high photostability. The excellent optical properties will owe them great potential in life science applications. In studying the above two systems, we have found, First, the small molecules or protein were adsorbed on the surface of NDs, and then the adsorbed coating was “crosslinked” either by polymerization or by stabilizing protein-protein interaction. Consequently, the ND was enclosed in cage. To avoid a few limitations above two coatings. The poly(L-DOPA) lost when being chemically modified. Moreover, the huge amount of aromatic groups quenched the fluorescence of NDs. The virus capsid can de-assemble under different ions strength and pH, it is concern the shell would remain stable in body fluids over longer time periods. Therefore the third approach called adsorption-crosslinking strategy was developed, it caged the NDs and endow the potential of the coating to NDs. In detail, Hyperbranched polyethyleneimine (PEI), a highly branched, cationic, aliphatic polymer with multiple primary/secondary amino groups, was selected to precoat the NDs where 4-armed polyethyleneglycol cross-linkers reacted with PEI to form a stable and covalent nanogel shell. The nanodiamond-nanogel system has demonstrated the ability to provide good stability and photodynamic therapy after conjugation with ruthenium complexes. Moreover, it was combined with indocyanine green (ICG), and the ND-NG-ICG system to demonstrate the ability to report temperature in the photothermal therapeutic process at the intracellular level. In summary, two special coatings inspired by nature were developed, i.e., poly(L-DOPA) by self-polymerization of L-DOPA inspired by mussel foot proteins and capsid protein from Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV). In addition, a general coating strategy called adsorption-crosslinking was explored to surround the nanodiamond with a nanogel network. Potential applications in life science were proven, such as photothermal effects, intracellular tracking, photodynamic therapy, and intracellular temperature sensing. This new approach offers the potential to enhance our understanding of local parameters in cancer cells and tissue and it could be of benefit in cancer research, especially early stage diagnosis and treatment. Die Krebserkrankung ist eine der größten gesundheitlichen Herausforderungen und betrifft Entwicklungs- sowie Industrieländer. Um die Situation zu verbessern, ist es daher essenziell sensitive Detektoren zur frühen Diagnose sowie fortschrittlichere Methoden zur Überwachung und Behandlung von Patienten zu entwickeln. Nanodiamanten (NDs) sind ein einzigartiges Nanomaterial basierend auf Kohlenstoff, aufgrund ihrer hervorragenden optischen und magnetischen Eigenschaften sowie ihrer ausgezeichneten Biokompatibilität. Daher haben sie die Aufmerksamkeit vieler Wissenschaftler*innen auf sich gezogen. Die optisch-aktiven Fehlstellen im Gitter der NDs, wie z.B. das Stickstoff-Fehlstellen-Zentrum (englisch: Nitrogen Vacancy (NV) center), sorgen für eine stabile Fluoreszenz, die keinerlei Photoblinken noch Photobleichen zeigt. Dies führte dazu, dass NDs weithin in der biologischen Bildgebung und als Echtzeit-Reporter bei der Medikamentenverabreichung eingesetzt wurden. Zudem können NDs, die negativ geladene NV (NV⁻) Zentren enthalten, als Single-Spin-Sensoren dienen, um wichtige physikalische Parameter in einer biologischen Mikroumgebung zu erkennen, wie z. B. Temperatur, Magnetfelder, Elektronenspins und mechanische Belastungen. Für die meisten dieser Anwendungen werden stabile und funktionalisierte Nanodiamanten (NDs) benötigt. Da die kolloidale Stabilität von unbehandelten NDs in Lösung sehr schlecht ist, verstärkt sich die Aggregation von ND drastisch, wenn die Größe des Diamanten in den Nanometerbereich sinkt. Darüber hinaus verbessert die Oberflächenfunktionalisierung die Einheitlichkeit der Oberfläche, die oft der Ausgangspunkt für die weitere Funktionalisierung von anderen Motiven, wie Medikamentenmoleküle, Farbstoffe, Targeting-Gruppen oder Antikörper, ist. Eine einheitliche Partikeloberfläche erhöht die Anzahl der Bindungsstellen und die Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist die Oberflächenbeschichtung für in vivo Anwendungen wichtig, um körpereigene Reaktionen gegenüber den Partikeln zu vermeiden und den Nanopartikeln zu helfen, sich anzureichern und über einen längeren Zeitraum an den Zielstellen zu verbleiben. In dieser Arbeit werden zwei neue, von der Natur inspirierte Beschichtungsmaterialien untersucht, um die Oberflächeneigenschaften von NDs zu optimieren. Das erste Beschichtungsmaterial ist Poly(L-DOPA), welches während der Selbstpolymerisation des Neurotransmitters L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) gebildet wird und seine Inspiration in dem "Proteinkleber" der Muschelfußproteine fand. Die Polymerisation von L-DOPA liefert ein hochvernetztes Polymer mit reaktiven, funktionalen Gruppen auf der Oberfläche, darunter Amine, Carbonsäuren, Alkohole und konjugierte Michael-Akzeptoren. L-DOPA polymerisiert auf NDs mit einer hohen Kontrolle über die Dicke der Beschichtung. Die anschließende Konjugation von Transferrin, die einen effizienten rezeptorspezifischen zellulären Transport ermöglicht, verbessert die kolloidale Stabilität und die zelluläre Aufnahme der Poly(L-DOPA)-beschichteten NDs. Die Beladung mit dem FDA-zugelassenen photothermischen Wirkstoff Indocyaningrün (ICG) ergibt ein integriertes biohybrides Nanomaterial, das einen verstärkten photothermischen Effekt in Zellen, bei sehr geringer Energieaufnahme (~90 mW/cm2), aufweist. Viren sind, durch die Evolution, optimierte Trägersysteme und wurden bereits zur Zellinvasion eingesetzt. Sie haben in den letzten Jahren großes Interesse als Instrumente zur Steigerung der Zellaufnahme erfahren. Das zweite Beschichtungsmaterial ist ein Kapsidprotein (englisch: capsid protein (CP)) aus dem Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV). CPs wurde zunächst aus dem CCMV isoliert, das anschließend zur Herstellung von hochstabilen, mit Viruskapsidprotein verkapselten NDs (ND-CP) verwendet wird. Es entsteht eine dünne Proteinschicht, die die NDs umgibt und reaktive Gruppen besitzt, sowie den NDs eine hohe kolloidale Stabilität verleiht. Die Proteinschicht beeinträchtigt die physikalischen Eigenschaften der NDs nicht. ND-CP zeigt eine gute zelluläre Aufnahme und eine ausgezeichnete Biokompatibilität sowohl in vitro als auch in vivo. Darüber hinaus wird das langfristige intrazelluläre Trafficking der ND-CP untersucht, das der hohen Photostabilität zu verdanken ist. Die exzellenten optischen Eigenschaften werden ihnen ein großes Potential in Life Science ermöglichen. Bei der Untersuchung der beiden oben genannten Systeme haben wir festgestellt, dass zunächst die kleinen Moleküle oder Proteine an der Oberfläche der NDs adsorbiert wurden und dann die adsorbierte Beschichtung entweder durch Polymerisation oder durch stabilisierende Protein-Protein-Wechselwirkung "vernetzt" wurde. Folglich waren die NDs in einer Hülle eingeschlossen. Es zeigten sich einige Limitationen: Das Poly(L-DOPA) ging bei der chemischen Modifikation verloren. Außerdem verringerte die große Menge an aromatischen Gruppen die Fluoreszenz der NDs. Das Viruskapsid kann sich bei verschiedenen Ionenstärken und pH-Werten disassemblieren und es ist zu befürchten, dass die Hülle in Körperflüssigkeiten über längere Zeiträume nicht stabil bleibt. Daher wurde der dritte Ansatz, die Adsorptions-Vernetzungs-Strategie entwickelt, die die NDs in einen Käfige einsperrt und den NDs das Potenzial der Beschichtung verleiht. Im Detail wurde hyperverzweigtes Polyethylenimin (PEI), ein hochverzweigtes, kationisches, aliphatisches Polymer mit mehreren primären/sekundären Aminogruppen, für die Vorbeschichtung der NDs ausgewählt, wobei 4-armige Polyethylenglykol-Vernetzer mit PEI reagierten, um eine stabile und kovalente Nanogel-Schale zu bilden. Das Nanodiamond-Nanogel-System hat gezeigt, dass es nach Konjugation mit Ruthenium-Komplexen eine gute Stabilität und photodynamische Therapie ermöglicht. Darüber hinaus wurde es mit Indocyaningrün (ICG) kombiniert, und das ND-NG-ICG-System demonstrierte die Fähigkeit, die Temperatur im photothermischen therapeutischen Prozess auf intrazellulärer Ebene zu messen. Zusammenfassend wurden zwei spezielle, von der Natur inspirierte Beschichtungen entwickelt, Poly(L-DOPA), durch Selbstpolymerisation von L-DOPA und inspiriert von Muschelfußproteinen und das Kapsidprotein aus dem Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV). Außerdem wurde eine Beschichtungsstrategie mit dem Namen Adsorptions-Vernetzung erforscht, um die Nanodiamanten mit einem Nanogel-Netzwerk zu umhüllen. Potenzielle Anwendungen in den Biowissenschaften wurden nachgewiesen, wie z. B. ein photothermischer Effekt, intrazelluläres Tracking, photodynamische Therapie und intrazelluläre Temperaturmessung. Dieser neue Ansatz bietet das Potenzial, unser Verständnis lokaler Parameter in Krebszellen und -gewebe zu verbessern und könnte in der Krebsforschung, insbesondere in frühen Stadien der Diagnose und Behandlung, von Nutzen sein.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6195
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-fded7800-dcdb-4998-b661-6f509a4686211
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	12, 197 Seiten, Illustrationen
Appears in collections:	JGU-Publikationen