Authors:	Schwonberg, Kirsten
Title:	Identifizierung von neuen Peptidkandidaten für die Impfstoff-Entwicklung gegen die murine kutane Leishmaniasis
Online publication date:	19-Apr-2021
Year of first publication:	2021
Language:	german
Abstract:	Infektionen mit dem Parasiten Leishmania (L.) major werden durch den Biss von Sandmücken hervorgerufen. Die Heilung der Leishmaniasis basiert auf der Sekretion von Interferon (IFN) durch CD4+ und CD8+ T-Zellen. Allerdings ist aktuell noch unklar, welche Proteine/Peptide des Parasiten für die Aktivierung der T-Helfer (Th)1-Zellen und somit für die Ausheilung der Erkrankung verantwortlich sind. Folglich existiert gegenwärtig noch kein adäquates Vakzin gegen die kutane Leishmaniasis. Da bisher nur ein einziges CD4+ T-Zell-spezifisches Peptid von L. major bekannt ist, das sogenannte LACK-Protein, ist die Identifikation weiterer Proteine und Peptide, die maßgeblich an der Heilung beteiligt sind, von großem Interesse. Um zunächst Peptide zu identifizieren, die aus dem LACK-Protein stammen und während der Immunisierung vermehrt die Freisetzung von IFN induzieren, wurde eine überlappende Peptid-Bibliothek des 36 kDa schweren LACK-Proteins erstellt. Diese besteht aus 47 zu untersuchenden Peptiden und 3 Kontrollpeptiden. Eine erhöhte Sekretion von IFN durch CD4+ oder CD8+ T-Zellen konnte durch keines der Peptide induziert werden. Allerdings wurde durch Peptid-spezifische Restimulation vermehrt IL-4 und IL-10 von beiden T-Zell-Populationen freigesetzt. Ein Th1/zytotoxische T-Zell (Tc)1-aktivierendes Peptid konnte in dieser Datenbank somit nicht identifiziert, die Th2 induzierende Eigenschaft des LACK-Proteins jedoch bestätigt werden. Um aus dem Gesamtpool an Proteinen und Peptiden des Parasiten mögliche Vakzinkandidaten zu identifizieren, wurden basierend auf vorangegangenen in silico Versuchen 300 Peptide aus beiden Lebensformen von L. major ausgewählt. Diese Peptide wurden entsprechend ihrer vorhergesagten Bindungsaffinität gegenüber MHC I-Molekülen ausgesucht, um anschließend auf ihre Bindungsstabilität, d.h., wie lange sie an MHC I-Molekülen binden können, genauer untersucht zu werden. Ergebnis war, dass es zwischen den beiden Parametern Bindungsaffinität und Bindungsstabilität keine Korrelation gibt. Die Auswahl an Peptiden konnte durch diese Verfahren nicht weiter eingegrenzt werden konnte, wurden schließlich alle 300 Peptide in in vitro Versuchen auf ihr spezifisches Zytokinprofil hin untersucht. Dafür wurden dendritische Zellen (DC) aus naiven C57BL/6 Mäusen generiert, die im Anschluss mit den jeweiligen Peptiden und MACS-aufgereinigten CD8+ T-Zellen aus infizierten C57BL/6 Mäusen für 48 h kokultiviert wurden. Die Überstände wurden anschließend mittels ELISA auf die sekretierten Mengen an IFN, IL-17A, IL-4 und IL-10 untersucht. 53 der analysierten Peptide induzierten bei den in der Kokultur vorhandenen CD8+ T-Zellen im Vergleich zu der Kontrolle ohne Antigen eine verstärkte IFN Sekretion. Basierend auf dem jeweiligen Zytokinprofil sind dann 15 verschiedene Peptide für weitere in vivo Versuche ausgewählt worden. Dafür sind C57BL/6 Mäuse zweimal intradermal in das eine Ohr - in einem sogenannten prime/boost (P/B)-Ansatz - mit je 10 µg Peptid in Kombination mit CpG als Adjuvanz immunisiert worden. Zwei Wochen später sind dieselben Mäuse mit 103 metazyklischen Promastigoten in das andere Ohr infiziert worden. Die Läsionen wurden wöchentlich gemessen. Drei der ausgewählten Peptide waren in der Lage, die Mäuse partiell vor einer Infektion mit L. major zu schützen, da die Ohrläsionen im Vergleich zu der PBS-Kontrollgruppe kleiner waren. Allerdings konnte dieser Effekt bei der genauen Analyse der Parasitenzahlen in der Milz und den Ohren nicht bestätigt werden. Die jeweilige Anzahl der Parasiten war stets vergleichbar mit der PBS-Kontrolle. Ebenso wenig konnten die Läsionen durch Verwendung von Peptid-Pools weiter reduziert werden. Daher wurde die Immunisierungsstrategie geändert. C57BL/6 Mäuse wurden nun in einem prime/boost/boost (P/B/B)-Ansatz zunächst mit 20 µg Peptid und CpG als Adjuvanz, gefolgt von zwei weiteren Immunisierungsschritten mit jeweils 10 µg Peptid intradermal in das eine Ohr immunisiert. Sieben Tage später wurden dieselben Mäuse mit 103 metazyklischen Promastigoten in das andere Ohr infiziert und die Läsionen wöchentlich gemessen. Das Peptid p54, das im P/B-Ansatz bereits die Ohrläsionen partiell reduzierte, konnte nun als mögliches Vakzin identifiziert werden, da es im Vergleich zu der PBS-Kontrolle die Läsionen signifikant über den gesamten Verlauf verkleinerte. Als Konklusion zeigte sich, dass das Peptid p54 potenziell mitverantwortlich für die Heilung der Leishmaniasis ist. Folgerichtig müssen weiterführende Versuche zeigen, ob p54 als mögliches Vakzin gegen die murine kutane Leishmaniasis fungieren kann. Zusammengefasst konnte anhand der vorgenannten Versuche die Ausgangsbasis geschaffen werden, um weiterführend an einem adäquaten Vakzin gegen dieses Humanpathogen zu forschen. Parasite Leishmania (L.) major infections are caused by the bite of a sand-fly. Healing is based on interferon (IFN)- secretion by CD8+ and CD4+ T cells. It is nonetheless still unclear, which proteins/peptides finally promote protection and long-lasting immunity against infections with L. major. Up to date, no vaccine against this human pathogen exists and only one single CD4+ T cell-specific protein is known so far: the LACK-protein. Thus, there is a high interest in identifying peptides that mediate healing of L. major infections. To allow the identification of potential peptides derived from the LACK-protein capable of inducing higher secretion of IFN and associated with activity during vaccination, an overlapping peptide-library of the 36 kDa LACK-protein consisting of 47 peptides and 3 control-peptides has been created. IL-4 and IL-10 secretion was enhanced when CD4+ and CD8+ T cells were stimulated with peptides whereas respective T cells did not secrete IFN when activated with any peptide. Based on previous in silico experiments, 300 peptides from both life-forms were chosen to be analysed as possible vaccines. These peptides were selected based on their predicted affinitiy to bind towards MHC class-I molecules. Additionally, all peptides were analysed for their binding-stability towards MHC class-I molecules. A correlation between the predicted affinity and measured stability of the peptides towards MHC class-I molecules was not observed. Further, all 300 peptides were tested in in vitro assays. To this goal, peptide-loaded dendritic cells of naïve C57BL/6 mice were co-cultured with primed CD8+ T cells for 48 hrs. Afterwards, supernatants were analysed for their amounts of IFN, IL-17A, IL-4 and IL-10. Interestingly, 53 peptides with induction of high amounts of IFN and low levels of IL-17A, IL-4 and IL-10 were identified. Based on their cytokine profile, 15 peptides were randomly choosen for further in vivo experiments. C57BL/6 mice were immunized intradermally in one ear in a prime/boost (P/B)-approach, using 10 µg peptide in combination with CpG as adjuvant twice. Two weeks later, same mice were infected with 103 metacyclic promastigotes in the alternate ear. Surprisingly, three of the analysed peptides were able to partially protect mice against challenge, as they had reduced lesion volumes compared to PBS control mice. By analysing the amount of parasites in ear and spleen in week 6 post infection, differences in parasite-numbers could not be observed compared to PBS-control-mice. To further reduce lesion volumes, C57BL/6 mice were immunized with peptide-pools consisting of at least three different peptides. But unfortunately, lesion volumes were not reduced compared to control. Using a different strategy, C57BL/6 mice were immunized in a prime/boost/boost (P/B/B)-approach. To reach this goal, mice were immunized once intradermally in one ear with 20 µg peptide in combination with CpG as adjuvant, followed by two immunization-steps with 10 µg peptide each time. One week later, mice were infected with 103 metacyclic promastigotes in the alternate ear. Lesion volumes were assessed weekly. Remarkably, p54, which partially protected mice against challenge using the P/B-approach, reduced lesion volumes significantly when mice were immunized in the P/B/B-approach. As a conclusion, peptide p54 could be perchance partially responsible for healing Leishmaniasis. Consequently further studies need to elaborate if p54 can be verified as a possible vaccine against murine cutaneous leishmaniasis. Summarizing the above, the previously described actions build a foundation on basis of which further studies need to obtain a long desired vaccine against this human pathogen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5738
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-8eaad8b5-f308-439f-8fa5-27c546bc425d6
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	XXX, 137 Blätter, Illustrationen, Diagramme
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