Identifizierung von neuen Peptidkandidaten für die Impfstoff-Entwicklung gegen die murine kutane Leishmaniasis
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
License
Abstract
Infektionen mit dem Parasiten Leishmania (L.) major werden durch den Biss von Sandmücken hervorgerufen. Die Heilung der Leishmaniasis basiert auf der Sekretion von Interferon (IFN) durch CD4+ und CD8+ T-Zellen. Allerdings ist aktuell noch unklar, welche Proteine/Peptide des Parasiten für die Aktivierung der T-Helfer (Th)1-Zellen und somit für die Ausheilung der Erkrankung verantwortlich sind. Folglich existiert gegenwärtig noch kein adäquates Vakzin gegen die kutane Leishmaniasis. Da bisher nur ein einziges CD4+ T-Zell-spezifisches Peptid von L. major bekannt ist, das sogenannte LACK-Protein, ist die Identifikation weiterer Proteine und Peptide, die maßgeblich an der Heilung beteiligt sind, von großem Interesse.
Um zunächst Peptide zu identifizieren, die aus dem LACK-Protein stammen und während der Immunisierung vermehrt die Freisetzung von IFN induzieren, wurde eine überlappende Peptid-Bibliothek des 36 kDa schweren LACK-Proteins erstellt. Diese besteht aus 47 zu untersuchenden Peptiden und 3 Kontrollpeptiden. Eine erhöhte Sekretion von IFN durch CD4+ oder CD8+
T-Zellen konnte durch keines der Peptide induziert werden. Allerdings wurde durch Peptid-spezifische Restimulation vermehrt IL-4 und IL-10 von beiden
T-Zell-Populationen freigesetzt. Ein Th1/zytotoxische T-Zell (Tc)1-aktivierendes Peptid konnte in dieser Datenbank somit nicht identifiziert, die Th2 induzierende Eigenschaft des LACK-Proteins jedoch bestätigt werden.
Um aus dem Gesamtpool an Proteinen und Peptiden des Parasiten mögliche Vakzinkandidaten zu identifizieren, wurden basierend auf vorangegangenen in silico Versuchen 300 Peptide aus beiden Lebensformen von L. major ausgewählt. Diese Peptide wurden entsprechend ihrer vorhergesagten Bindungsaffinität gegenüber MHC I-Molekülen ausgesucht, um anschließend auf ihre Bindungsstabilität, d.h., wie lange sie an MHC I-Molekülen binden können, genauer untersucht zu werden. Ergebnis war, dass es zwischen den beiden Parametern Bindungsaffinität und Bindungsstabilität keine Korrelation gibt. Die Auswahl an Peptiden konnte durch diese Verfahren nicht weiter eingegrenzt werden konnte, wurden schließlich alle 300 Peptide in in vitro Versuchen auf ihr spezifisches Zytokinprofil hin untersucht. Dafür wurden dendritische Zellen (DC) aus naiven C57BL/6 Mäusen generiert, die im Anschluss mit den jeweiligen Peptiden und MACS-aufgereinigten CD8+ T-Zellen aus infizierten C57BL/6 Mäusen für 48 h kokultiviert wurden. Die Überstände wurden anschließend mittels ELISA auf die sekretierten Mengen an IFN, IL-17A, IL-4 und IL-10 untersucht. 53 der analysierten Peptide induzierten bei den in der Kokultur vorhandenen CD8+ T-Zellen im Vergleich zu der Kontrolle ohne Antigen eine verstärkte IFN Sekretion. Basierend auf dem jeweiligen Zytokinprofil sind dann 15 verschiedene Peptide für weitere in vivo Versuche ausgewählt worden. Dafür sind C57BL/6 Mäuse zweimal intradermal in das eine Ohr - in einem sogenannten prime/boost (P/B)-Ansatz - mit je 10 µg Peptid in Kombination mit CpG als Adjuvanz immunisiert worden. Zwei Wochen später sind dieselben Mäuse mit 103 metazyklischen Promastigoten in das andere Ohr infiziert worden. Die Läsionen wurden wöchentlich gemessen. Drei der ausgewählten Peptide waren in der Lage, die Mäuse partiell vor einer Infektion mit L. major zu schützen, da die Ohrläsionen im Vergleich zu der PBS-Kontrollgruppe kleiner waren. Allerdings konnte dieser Effekt bei der genauen Analyse der Parasitenzahlen in der Milz und den Ohren nicht bestätigt werden. Die jeweilige Anzahl der Parasiten war stets vergleichbar mit der PBS-Kontrolle. Ebenso wenig konnten die Läsionen durch Verwendung von Peptid-Pools weiter reduziert werden. Daher wurde die Immunisierungsstrategie geändert. C57BL/6 Mäuse wurden nun in einem prime/boost/boost (P/B/B)-Ansatz zunächst mit 20 µg Peptid und CpG als Adjuvanz, gefolgt von zwei weiteren Immunisierungsschritten mit jeweils 10 µg Peptid intradermal in das eine Ohr immunisiert. Sieben Tage später wurden dieselben Mäuse mit 103 metazyklischen Promastigoten in das andere Ohr infiziert und die Läsionen wöchentlich gemessen. Das Peptid p54, das im P/B-Ansatz bereits die Ohrläsionen partiell reduzierte, konnte nun als mögliches Vakzin identifiziert werden, da es im Vergleich zu der PBS-Kontrolle die Läsionen signifikant über den gesamten Verlauf verkleinerte.
Als Konklusion zeigte sich, dass das Peptid p54 potenziell mitverantwortlich für die Heilung der Leishmaniasis ist. Folgerichtig müssen weiterführende Versuche zeigen, ob p54 als mögliches Vakzin gegen die murine kutane Leishmaniasis fungieren kann. Zusammengefasst konnte anhand der vorgenannten Versuche die Ausgangsbasis geschaffen werden, um weiterführend an einem adäquaten Vakzin gegen dieses Humanpathogen zu forschen.