Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der essenziellen Oxidoreduktase Tryparedoxin aus Trypanosoma brucei - Interaktionen mit Trypanothion und dem kovalenten Inhibitor CFT
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Trypanosoma brucei sind parasitäre Protozoen und die Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit im Menschen und der Tierseuche Nagana. Trypanosomen haben einen ungewöhnlichen Thiol-basierte Redox-Stoffwechsel, der auf Trypanothion (T(SH)₂) und der Trypanothion-Reduktase (TR) basiert. Neben anderen Redox-Partnern überträgt T(SH)₂ Elektronen auf die essenzielle Oxidoreduktase Tryparedoxin (Tpx). Tpx reduziert dann z. B. Peroxidasen zur Entgiftung von Peroxiden und spielt damit eine Schlüsselrolle im Thiol-basierte Redox-Stoffwechsel der Trypanosomen.
Der erste Teil dieser Dissertation untersucht die Struktur und Dynamik von Tpx im oxidierten, reduzierten und Trypanothion-gebundenen Zustand. Im Gegensatz zu den verfügbaren Kristallstrukturen von Tpx zeigte die Kernspinresonanz- (NMR-) Spektroskopie, dass die Änderung des Redox-Zustands von Tpx eine strukturelle Veränderung über das aktive Zentrum hinaus bewirkt. Heteronukleare Overhauser-Effekt- (hetNOE-) Messungen an oxidiertem und reduziertem Tpx zeigten, dass sich die Dynamik von Tpx vom oxidierten in den reduzierten Zustand ausschließlich im aktiven Zentrum verändert. Des Weiteren deuten NMR-spektroskopische Untersuchungen der Tpx-T(SH)₂-Interaktion auf ein kovalentes und nicht-kovalentes Bindeereignis hin, wobei letzteres konzentrationsabhängig ist. Basierend auf den Veränderungen der chemischen Verschiebung wurden die Aminosäuren identifiziert, die vermutlich an einer initialen Bindung und der Komplexformation von Tpx und T(SH)₂ beteiligt sind. Darüber hinaus konnte eine unerwartet lange Halbwertszeit von ~4,8 h für den isolierten Tpx-T(SH)₂-Komplex bestimmt werden. Tpx Proteine kommen in allen Trypanosomatiden vor. Sie enthalten vier hochkonservierte Tryptophanreste. Die Untersuchungen der Tryptophanreste in T. brucei Tpx deuten auf eine wichtige Rolle der Tryptophanreste für die Struktur und Interaktion von Tpx mit T(SH)₂ hin.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Interaktion von Tpx mit CFT (2-(Chlormethyl)-5-(4-fluorphenyl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on), einem kovalenten Inhibitor, der mit Cys40 im aktiven Zentrum von Tpx interagiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die kovalente Bindung von CFT an Cys40 im aktiven Zentrum von Tpx für die Inhibition und die Protein-Inhibitor-Wechselwirkung essenziell ist. In Zusammenarbeit mit , Universität Würzburg, wurde die erste Kristallstruktur von Tpx im Komplex mit einem Inhibitor, CFT, in hoher Auflösung (1,6 Å und 1,8 Å) bestimmt. Der Tpx-CFT-Komplex liegt unerwarteterweise als Dimer vor. Analytische Größenausschlusschromatographie (SEC), Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS), Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit Weitwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) und NMR-Messungen demonstrieren die Tpx-CFT-Dimerbildung auch in Lösung. Mittels isothermer Verdünnungs-Titrationskalorimetrie (ITC) wurde ein KD von 5,7 µM für die Dissoziation des Dimerkomplexes bestimmt. Inter- und intramolekulare Interaktionen des Tpx₂-CFT₂-Komplexes wurden in den Kristallstrukturen und durch Molekulardynamik- (MD-) Simulationen identifiziert (in Zusammenarbeit mit , Universität Würzburg). Analytische SEC-, SAXS-, NMR- und SEC-MALS-Experimente zeigten, dass die in der Kristallstruktur und in MD-Simulationen identifizierten intermolekularen Inhibitor-Inhibitor- und Inhibitor-Protein-Interaktionen essenziell für die Dimerformation sind und die intermolekularen Protein-Protein-Interaktionen den Dimerkomplex stabilisieren. CFT ist ein fluorinierter Inhibitor. Aufgrund des hohen gyromagnetischen Verhältnisses und der daraus resultierenden hohen Empfindlichkeit des -1/2 Spins ist ¹⁹F ein interessanter Nukleus für NMR-spektroskopische Untersuchungen. In einer systematischen Untersuchung der ¹⁹F-Resonanz von CFT in Lösung und gebunden an monomeres oder dimeres Tpx wurden experimentelle Ergebnisse mit quantenmechanischen/molekularmechanischen- (QM/MM-) Berechnungen verbunden (in Zusammenarbeit mit , LMU München). Dies demonstriert die Fähigkeit von computergestützten Ansätzen zur qualitativen Vorhersage der Bindungsmodi von fluorierten Molekülen an Proteine auf Grundlage der beobachteten ¹⁹F-Resonanzen.
Diese Dissertation stellt die erste Kristallstruktur von Tpx im Komplex mit einem kovalenten Inhibitor vor und enthüllt eine unerwartete Inhibitor-induzierte Dimerisierung von Tpx. Außerdem erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis der molekularen Wechselwirkung von Tpx mit T(SH)₂, welche sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig ist.