Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-5684
Authors: Wagner, Annika
Title: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der essenziellen Oxidoreduktase Tryparedoxin aus Trypanosoma brucei - Interaktionen mit Trypanothion und dem kovalenten Inhibitor CFT
Online publication date: 16-Mar-2021
Language: german
Abstract: Trypanosoma brucei sind parasitäre Protozoen und die Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit im Menschen und der Tierseuche Nagana. Trypanosomen haben einen ungewöhnlichen Thiol-basierte Redox-Stoffwechsel, der auf Trypanothion (T(SH)₂) und der Trypanothion-Reduktase (TR) basiert. Neben anderen Redox-Partnern überträgt T(SH)₂ Elektronen auf die essenzielle Oxidoreduktase Tryparedoxin (Tpx). Tpx reduziert dann z. B. Peroxidasen zur Entgiftung von Peroxiden und spielt damit eine Schlüsselrolle im Thiol-basierte Redox-Stoffwechsel der Trypanosomen. Der erste Teil dieser Dissertation untersucht die Struktur und Dynamik von Tpx im oxidierten, reduzierten und Trypanothion-gebundenen Zustand. Im Gegensatz zu den verfügbaren Kristallstrukturen von Tpx zeigte die Kernspinresonanz- (NMR-) Spektroskopie, dass die Änderung des Redox-Zustands von Tpx eine strukturelle Veränderung über das aktive Zentrum hinaus bewirkt. Heteronukleare Overhauser-Effekt- (hetNOE-) Messungen an oxidiertem und reduziertem Tpx zeigten, dass sich die Dynamik von Tpx vom oxidierten in den reduzierten Zustand ausschließlich im aktiven Zentrum verändert. Des Weiteren deuten NMR-spektroskopische Untersuchungen der Tpx-T(SH)₂-Interaktion auf ein kovalentes und nicht-kovalentes Bindeereignis hin, wobei letzteres konzentrationsabhängig ist. Basierend auf den Veränderungen der chemischen Verschiebung wurden die Aminosäuren identifiziert, die vermutlich an einer initialen Bindung und der Komplexformation von Tpx und T(SH)₂ beteiligt sind. Darüber hinaus konnte eine unerwartet lange Halbwertszeit von ~4,8 h für den isolierten Tpx-T(SH)₂-Komplex bestimmt werden. Tpx Proteine kommen in allen Trypanosomatiden vor. Sie enthalten vier hochkonservierte Tryptophanreste. Die Untersuchungen der Tryptophanreste in T. brucei Tpx deuten auf eine wichtige Rolle der Tryptophanreste für die Struktur und Interaktion von Tpx mit T(SH)₂ hin. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Interaktion von Tpx mit CFT (2-(Chlormethyl)-5-(4-fluorphenyl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-on), einem kovalenten Inhibitor, der mit Cys40 im aktiven Zentrum von Tpx interagiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die kovalente Bindung von CFT an Cys40 im aktiven Zentrum von Tpx für die Inhibition und die Protein-Inhibitor-Wechselwirkung essenziell ist. In Zusammenarbeit mit , Universität Würzburg, wurde die erste Kristallstruktur von Tpx im Komplex mit einem Inhibitor, CFT, in hoher Auflösung (1,6 Å und 1,8 Å) bestimmt. Der Tpx-CFT-Komplex liegt unerwarteterweise als Dimer vor. Analytische Größenausschlusschromatographie (SEC), Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS), Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit Weitwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) und NMR-Messungen demonstrieren die Tpx-CFT-Dimerbildung auch in Lösung. Mittels isothermer Verdünnungs-Titrationskalorimetrie (ITC) wurde ein KD von 5,7 µM für die Dissoziation des Dimerkomplexes bestimmt. Inter- und intramolekulare Interaktionen des Tpx₂-CFT₂-Komplexes wurden in den Kristallstrukturen und durch Molekulardynamik- (MD-) Simulationen identifiziert (in Zusammenarbeit mit , Universität Würzburg). Analytische SEC-, SAXS-, NMR- und SEC-MALS-Experimente zeigten, dass die in der Kristallstruktur und in MD-Simulationen identifizierten intermolekularen Inhibitor-Inhibitor- und Inhibitor-Protein-Interaktionen essenziell für die Dimerformation sind und die intermolekularen Protein-Protein-Interaktionen den Dimerkomplex stabilisieren. CFT ist ein fluorinierter Inhibitor. Aufgrund des hohen gyromagnetischen Verhältnisses und der daraus resultierenden hohen Empfindlichkeit des -1/2 Spins ist ¹⁹F ein interessanter Nukleus für NMR-spektroskopische Untersuchungen. In einer systematischen Untersuchung der ¹⁹F-Resonanz von CFT in Lösung und gebunden an monomeres oder dimeres Tpx wurden experimentelle Ergebnisse mit quantenmechanischen/molekularmechanischen- (QM/MM-) Berechnungen verbunden (in Zusammenarbeit mit , LMU München). Dies demonstriert die Fähigkeit von computergestützten Ansätzen zur qualitativen Vorhersage der Bindungsmodi von fluorierten Molekülen an Proteine auf Grundlage der beobachteten ¹⁹F-Resonanzen. Diese Dissertation stellt die erste Kristallstruktur von Tpx im Komplex mit einem kovalenten Inhibitor vor und enthüllt eine unerwartete Inhibitor-induzierte Dimerisierung von Tpx. Außerdem erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis der molekularen Wechselwirkung von Tpx mit T(SH)₂, welche sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig ist.
Trypanosoma brucei are protozoan parasites and the causing agents of human African trypanosomiasis (African Sleeping Sickness) and the animal disease Nagana. Trypanosomes have an unusual thiol-based redox metabolism based on trypanothione (T(SH)₂) and trypanothione reductase (TR). Among other redox partners, T(SH)₂ transfers electrons to the essential oxidoreductase Tryparedoxin (Tpx). Tpx then reduces e.g. peroxidases to detoxify peroxides and thus plays a key role in the thiol-based redox metabolism of trypanosomes. The first part of this PhD thesis investigates the structure and dynamics of Tpx in the oxidized, reduced and trypanothione-bound state. In contrast to the available X-ray structures of Tpx, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy shows that the redox switch of Tpx causes structural changes beyond the active site. Heteronuclear Overhauser Effect (hetNOE) measurements on oxidized and reduced Tpx showed that upon switching between redox states, only the active site is dynamically perturbed. Furthermore, NMR spectroscopic investigations of the Tpx-T(SH)₂ interactions suggest a covalent and non-covalent binding event, the latter being concentration dependent. The amino acids that are presumably involved in the initial binding event and the complex formation of Tpx and T(SH)₂ were identified based on the NMR chemical shift perturbations. Moreover, an unexpectedly long half-life of ~4.8 h for the isolated Tpx-T(SH)₂-complex could be determined. Tpx proteins are present in all trypanosomatids. They contain four highly conserved tryptophane residues. The investigation of the tryptophane residues from T. brucei Tpx suggest an important role of the tryptophanes for the structure and interaction of Tpx with T(SH)₂. The second part of this thesis follows up on the interaction of Tpx with CFT (2-(chloromethyl)-5-(4-fluorophenyl)-thieno[2,3-d]pyrimidin-4(3H)-one), a covalent inhibitor that interacts with the active site residue Cys40 in Tpx. In the course of this thesis it was shown that the covalent interaction of CFT with the active site residue Cys40 in Tpx is essential for the inhibition and the inhibitor-protein-interaction. In collaboration with , University of Würzburg, the X-ray structure of Tpx in complex with CFT, which represents the first structure of a tryparedoxin with any inhibitor, was determined at high resolution (1,6 Å und 1,8 Å). Unexpectedly, the Tpx-CFT-complex forms a dimer in the crystal structure. Analytical size exclusion chromatography (SEC), small-angle X-ray scattering (SAXS), size exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering (SEC-MALS) and NMR spectroscopy clearly demonstrate the existence of the Tpx-CFT-dimer formation also in solution. A KD of 5.7 µM for the dissociation of the dimer complex was determined by dilution isothermal titration calorimetry (ITC). Inter- and intramolecular interactions of the Tpx₂-CFT₂-complex were identified in the crystal structures and by molecular dynamics (MD) simulations (in collaboration with , University of Würzburg). The importance of the intermolecular inhibitor-inhibitor- and inhibitor-protein-interactions identified in the crystal structure for dimer formation and stabilization could be verified by mutagenesis and subjecting mutant proteins to analytical SEC, SAXS, NMR and SEC-MALS experiments. CFT is a fluorinated inhibitor. Because of the high gyromagnetic ratio and the resulting high sensitivity of the -1/2 spin, ¹⁹F is an interesting nucleus for NMR-spectroscopic investigations. In a systematic study of the ¹⁹F resonance of CFT in solution and bound to monomeric or dimeric Tpx, experimental results were combined with quantum mechanical/molecular mechanical (QM/MM) calculations (in collaboration with , LMU Munich). This demonstrated the ability of computational approaches to qualitatively predict the binding modes of fluorinated molecules to proteins based on the observed ¹⁹F resonances. This thesis presents the first crystal structure of Tpx in complex with a covalent inhibitor and reveals an unexpected inhibitor-induced dimerization of Tpx. In addition, the present work expands the understanding of the molecular interaction of Tpx with T(SH)₂, which is both concentration- and time-dependent.
DDC: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5684
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-65d29ad0-3e90-443d-83ec-4c647f195eae6
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XXV, 232 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
wagner_annika-strukturelle_u-20210310165533518.pdf22.65 MBAdobe PDFView/Open