Authors:	Schwickert, Kevin
Title:	Design, Synthese und biologische Evaluierung neuer TRP-Ionenkanal-Aktivatoren Synthese und Reaktivität neuer Bortezomib-Kongenere mit diversen Warheads als potenzielle Proteasom-Inhibitoren
Online publication date:	10-Feb-2022
Year of first publication:	2022
Language:	german
Abstract:	Mutationen im humanen TRPML1-Ionenkanal sind für die autosomal-rezessive lysosomale Speicherkrankheit Mucolipidose Typ IV (MLIV) verantwortlich, die klinisch vor allem durch tiefgreifende neurobiologische Entwicklungsstörungen, neuroretinale Degeneration sowie Eisenmangelanämie charakterisiert ist. Der synthetische TRPML1-Agonist MK6-83 kann die Funktion spezifischer, mutierter TRPML1-Isoformen wiederherstellen, jedoch sind die genaue Lage der Bindungsstelle innerhalb des Ionenkanals und die zugrunde liegenden Aktivierungsmechanismen bisher noch nicht bekannt. Zur Aufklärung der Schlüsselinteraktionen zwischen dem Liganden und dem Rezeptor wurden zwei photoreaktive (Trifluormethyl)diazirin-basierte Analoga entwickelt, synthetisiert und in umfassenden Photoaktivierungsstudien mittels 19F-NMR-Spektroskopie und HPLC-MS-Analyse kinetisch evaluiert. Diese photoaktivierbaren TRPML1-Agonisten stellen sehr nützliche und wertvolle Werkzeuge für die Identifizierung der Bindestelle von MK6-83 mithilfe von Photoaffinity Labeling in Kombination mit einem Proteomik-Massenspektrometrie-Ansatz dar, sodass das strukturbasierte Design neuer und potenterer TRPML-Aktivatoren zur Behandlung der Mucolipidose Typ IV maßgeblich gefördert werden kann. Zudem wurden detaillierte Analysen mithilfe fortgeschrittener, computergestützter Methoden basierend auf der hochauflösenden Kristallstruktur der extracytosolischen/lumenalen Domäne (ELD) des humanen TRPML2-Kanals durchgeführt, sodass ein signifikanter Beitrag zu dessen strukturellen und funktionellen Charakterisierung geleistet wurde. Im Rahmen eines Design- und Synthesezyklus wurden darüber hinaus >45 neue potenzielle TRPML- sowie TRPC6-Aktivatoren auf Grundlage bekannter Agonisten entwickelt. Anhand der Befunde aus zukünftigen biologischen Studien könnten mögliche Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet und wertvolle Informationen zur Entwicklung potenterer und selektiverer Liganden für die Behandlung von MLIV bzw. Depressionen gewonnen werden. Proteasom-Inhibitoren haben sich in den letzten Jahren in der Klinik zur Behandlung verschiedener nicht-solider Tumore wie dem Multiplen Myelom oder dem Mantelzell-Lymphom bewährt. Ihre therapeutische Anwendung ist jedoch aufgrund der Toxizität und der damit verbundenen häufig auftretenden, schwerwiegenden Nebenwirkungen limitiert, weshalb nach wie vor großes Interesse an der Entwicklung neuer und selektiverer Proteasom-Inhibitoren besteht. Um die Sicherheit von Proteasom-Hemmstoffen zu verbessern und eine spezifischere Inhibition durch Modulation der Reaktivität zu gewährleisten, wurden neuartige Moleküle auf Grundlage des hochaffinen Proteasom-Inhibitors Bortezomib konzipiert. Es wurden verschiedene bisher unerforschte elektrophile Warheads in das peptidomimetische Grundgerüst integriert, wobei das Inhibitordesign durch (nicht-)kovalente molekulare Dockingstudien und Analyse der resultierenden Bindemodi unterstützt wurde. Die potenziellen Inhibitoren wurden in umfangreichen Synthesen und Analysen erfolgreich dargestellt und in ersten biologischen Assays an der Chymotrypsin-ähnlichen Untereinheit des humanen 20S-Proteasoms zur Einordnung ihrer in vitro-Wirksamkeit evaluiert. Mutations in the human TRPML1 channel, a member of the mucolipin subfamily of the Transient Receptor Potential (TRP) ion channels, are responsible for the autosomal recessive lysosomal storage disease Mucolipidosis Type IV (MLIV) which is clinically characterized by profound neurobiological developmental disorders, neuroretinal degeneration and iron deficiency anemia. The synthetic TRPML1 agonist MK6-83 can restore the function of specific TRPML1 mutant isoforms but the exact location of the binding site within the ion channel and the underlying mechanisms of activation remain unknown. To elucidate the key interactions between the ligand and the receptor, two photoreactive (trifluoromethyl)diazirine-based analogues were developed, synthesized, and kinetically evaluated in comprehensive photoactivation studies by 19F-NMR spectroscopy and HPLC-MS analysis. These photoactivatable TRPML1 agonists represent very useful and valuable tools for the identification of the binding site of MK6-83 via photoaffinity labeling in combination with a proteomics mass spectrometry approach. The knowledge gained from these studies will significantly enhance the structure-based design of new and more potent TRPML activators for the treatment of Mucolipidosis type IV. Furthermore, detailed analyses on the high-resolution crystal structure of the extracytosolic/lumenal domain (ELD) of the human TRPML2 channel were performed using advanced computer-based methods, thus making a significant contribution to its structural and functional characterization. In addition, >45 new potential TRPML and TRPC6 activators based on known agonists were developed in design and synthesis cycles for their biological evaluation in subsequent experiments and future projects. These findings could be used to derive possible structure-activity relationships and could provide valuable information for the development of more potent as well as selective ligands for the treatment of MLIV and depression, respectively. Proteasome inhibitors have been clinically proven in recent years for the treatment of various non-solid tumors such as multiple myeloma or mantle cell lymphoma. However, their therapeutic application is limited due to their toxicity and the associated frequent and serious side effects, highlighting the great interest in the development of new and more selective inhibitors. To improve the safety profile of proteasome inhibitors and to ensure a more specific inhibition by modulating their reactivity, novel molecules based on the high-affinity proteasome inhibitor Bortezomib have been designed. The inhibitor design included several previously unexplored electrophilic warheads that were integrated into the peptidomimetic backbone and was supported by (non-)covalent molecular docking studies and analysis of the resulting binding modes. These potential proteasome inhibitors were successfully synthesized and evaluated in first biological assays on the chymotrypsin-like subunit of the human 20S proteasome to determine their efficacy in vitro.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5657
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-7419da5d-9244-455a-9243-897a397dda385
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xxiv, 541 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen