Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-5619
Authors: Reinkemeier, Christopher Dieter
Advisor: Lemke, Edward A.
Title: Spatially Confining Translation to Enable Optimized Genetic Code Expansion in Eukaryotes
Online publication date: 23-Feb-2022
Year of first publication: 2022
Language: english
Abstract: The genetic code is the operating system of every living cell. It is executed through the central dogma of molecular biology and defines how the ribosome translates genetic information into a polypeptide. The genetic code is conserved throughout all domains of life and encodes three stop codons as well as the incorporation of the canonical amino acids. The naturally occurring amino acids can be classified in four different chemical functionalities (nonpolar, polar, basic and acidic). Despite this simplicity the genetic code gives rise to the entire diversity seen across all kingdoms of life and it can only be imagined how life might look like if the ribosome could also incorporate noncanonical amino acids (ncAAs), covering the full spectrum of chemical functionalities, into proteins. Genetic code expansion (GCE) is a powerful method to site-specifically incorporate ncAAs into proteins in vivo. To this end, typically an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase/tRNA (RS/tRNA) suppressor pair is used to reassign a rare stop codon to be read as a sense codon. During the last decades of research GCE has been established to permit the genetic incorporation of a plethora of ncAAs, which have for example been used to enable site-specific protein labeling for super-resolution microscopy. However, for imaging applications as well as for applications aiming to synthesize fully artificial polymers in eukaryotes, the current technology has at least three major limitations. First, GCE is codon specific but it cannot distinguish the mRNA of the protein of interest from endogenous mRNAs, leading to recoding of untargeted codons in the transcriptome. Due to this activity, GCE can have adverse side effects or even be toxic. Second, only a few orthogonal RS/tRNA suppressor pairs have been established for eukaryotic systems and third, only two different stop codons can be suppressed at a time. In this cumulative thesis I address the first problem, by developing synthetic membraneless organelles that allow to selectively translate only selected mRNAs with an expanded genetic code (Chapters2&3 and Appendix II). An alternative development using inducible expression systems, allowing to regulate the GCE components, is presented in Chapter 2 and Appendix IV. I further develop multiple mutually orthogonally translating organelles to equip cells with multiple genetic codes, which represents a new way to obtain orthogonal RS/tRNA suppressor pairs and enables to multiple times reassign the same stop codon, thus solving the remaining two major contemporary limitation of GCE (Chapter 5).
Der genetische Code ist das Betriebssystem jeder lebenden Zelle. Er wird durch das zentrale Dogma der Molekularbiologie ausgeführt und bestimmt wie das Ribosom genetische Information in eine Polypeptidsequenz übersetzt. Er ist konserviert in allen Domänen des Lebens und codiert drei Stopcodons sowie den Einbau der kanonischen Aminosäuren. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren können in vier unterschiedlich chemische Funktionalitäten klassifiziert werden (unpolar, polar, basisch und sauer). Trotz dieser Schlichtheit, führt der genetische Code zu der gesamten Diversität die in allen Königreichen des Lebens zu sehen ist und man kann sich nur vorstellen wie das Leben aussehen könnte, wenn das Ribosom nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs) in Protein einbauen könnte, die das gesamte Spektrum chemischer Funktionalitäten abdecken. Die Erweiterung des genetischen Codes (GCE) ist eine wirksame Methode um ncAAs seitenspezifisch in vivo in Protein einzubauen. Dazu wird normalerweise ein orthogonales Aminoacyl-tRNA-synthetase/tRNA (RS/tRNA) Suppressionspaar verwendet, um ein seltenes Stopcodon als Sensecodon neu zu belegen. In den letzten Jahrzehnten wurde der Einbau einer Vielzahl von ncAAs mithilfe der GCE Forschung etabliert, welche zum Beispiel verwendet wurden, um seitenspezifische Proteinmarkierung für hochauflösende Mikroskopie zu ermöglichen. Allerdings ist die GCE Technologie sowohl für Mikroskopie als auch für die Herstellung vollständig künstlicher Proteine in Eukaryoten durch mindestens drei große Probleme limitiert. Erstens, GCE ist codonspezifisch, kann aber nicht die mRNA des Zielproteins von anderen mRNAs unterscheiden, wodurch weitere Codons im Transkriptom unterdrückt werden können, was toxisch sein kann. Zweitens, nur wenige orthogonal RS/tRNA Paare sind für Eukaryoten etabliert, und drittens maximal zwei Stopcodons können gleichzeitig unterdrückt werden. In dieser Arbeit habe ich das erste Problem adressiert, indem ich synthetische, membranlose Organellen entwickelt habe, die es erlauben nur ausgewählte mRNAs mit einem erweiterten genetischen Code zu übersetzen (Chapter 2&3 und Appendix II). Eine alternative Entwicklung von induzierbaren Expressionssystemen, die es erlauben GCE Komponenten zu regulieren ist in Chapter 2 und Appendix IV präsentiert. Des Weiteren, habe ich mehrere zueinander orthogonale Organellen entwickelt, die Zellen mit multiplen genetischen Codes ausstatten, was einen komplett neuen Weg darstellt um orthogonale RS/tRNA Suppressions- paare zu erhalten und es ermöglicht das gleiche Stopcodon mehrfach neu zu belegen, dadurch werden die verbleibenden zwei aktuellen Probleme der GCE Technologie gelöst (Chapter 5).
DDC: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5619
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-d62147ef-b69d-4000-9675-862b593f78da9
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: Getrennte Zählung
Appears in collections:JGU-Publikationen

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