Authors:	Lence, Tina
Advisor:	Roignant, Jean-Yves
Title:	The role of m6A modification on mRNA processing in Drosophila melanogaster
Online publication date:	21-Jan-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	Over 170 RNA modifications can decorate various RNA molecules and represent one of the layers of gene regulation. N6-methyladenosine (m6A) is among the most prevalent modifications in eukaryotic mRNA and is implicated in nearly every step of mRNA biogenesis. m6A installation is accomplished by a large protein complex, whose exact composition was long unknown. This modification can be recognised by the so-called YTH domain-containing m6A reader proteins that are main mediators of m6A functions. Using molecular biology techniques and high-throughput sequencing experiments this study shows that the m6A writer complex in D. melanogaster consists of seven subunits that are conserved in higher eukaryotes. Methyltransferase-like protein 3 (Mettl3) carries catalytic activity and forms a heterodimer with the Methyltransferase-like protein 14 (Mettl14). In addition, five accessory proteins were found to be required for efficient target methylation: Fl(2)d, Vir, Nito, Flacc, and Hakai. Flacc was shown to promote the interaction between Fl(2)d and Nito, whereas Hakai maintained the stability of Vir, Fl(2)d and Flacc. Analysis of m6A distribution along mRNA revealed enrichment of modification within 5` UTR regions in an A-rich RRACH sequence motif. Functionally, loss of m6A altered alternative splicing. Among aberrantly spliced transcripts was Sex lethal (Sxl), the master regulator of sex determination and dosage compensation pathways in D. melanogaster, which implicated m6A in the modulation of these processes. Characterisation of m6A readers identified the nuclear protein Ythdc1 as one of the key mediators of m6A functions in D. melanogaster. By exploring the importance of m6A modification during fly development, this work revealed high levels of m6A during early embryogenesis, at the onset of pupation, as well as in heads and ovaries of adult flies. Notably, fly mutants lacking Mettl3 or Mettl14 had reduced lifespan and were flightless. In addition, flies lacking m6A displayed severe locomotion defects due to altered neuronal functions and loss of Ythdc1 resembled the loss of m6A writer components. RNA Moleküle können durch Über 170 RNA-Modifikationen markiert werden und stellen eine der wichtigsten Schichten der Genregulation dar. N6-Methyladenosin (m6A) gehört zu den am häufigsten vorkommenden Modifikationen in eukaryotischer mRNA und ist an nahezu allen Schritten der mRNA-Biogenese beteiligt. Die m6A Modifikation erfolgt durch einen großen Proteinkomplex, dessen genaue Zusammensetzung lange unbekannt war. Diese Modifikation kann durch die sogenannten YTH-Domäne-enthaltenen m6A-Leserproteine erkannt werden, die Hauptmediatoren der m6A-Funktionen sind. Hierfür werden molekularbiologische Methoden zusammen mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsexperimenten angewendet. Diese Methoden sollen helfen Komponenten des sogenannten "m6A-Schreiber-Komplex" der die m6A-Modifikation katalysiert zu identifizieren und charakterisieren. Genspezifische Knockout-Modelle wurden unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Genom-Engineerings erzeugt, um die m6A-Funktionen in D. melanogaster zu untersuchen. Insgesamt wurden die sieben Untereinheiten des m6A-Schreiber-Komplex in D. melanogaster identifiziert. Alle Untereinheiten sind in höheren Eukaryoten konserviert. Das Methyltransferase-ähnliche Protein 3 (Mettl3) trägt als einziges katalytische Aktivität und bildet mit dem Methyltransferase-ähnlichen Protein 14 (Mettl14) ein Heterodimer. Neben diesen entscheidenden Proteinen sind fünf weitere für eine effiziente Zielmethylierung erforderlich: Fl(2)d, Vir, Nito, Flacc und Hakai. Hierbei stärkt Flacc die Wechselwirkung zwischen Fl(2)d- und Nito-Proteinen, während Hakai die Stabilität von Vir-, Fl(2)d- und Flacc-Proteinen stabilisiert. Die Analyse der m6A-Verteilung entlang der mRNA ergab eine Anreicherung der Modifikation im 5'-UTR- innerhalb eines A-reichen RRACH-Sequenzmotiv. Funktionell veränderte der Verlust von m6A das alternative Spleißen einiger modifizierter Transkripte. Unter den fehlerhaft gespleißten Transkripten befand sich unter anderem der Hauptregulator der Geschlechtsbestimmung und der Dosierungskompensationswege, Sex lethal (Sxl), der die Verbindung zwischen m6A und der Regulierung dieser Prozesse verdeutlicht. Durch die Charakterisierung von m6A-Lesern wurde das nukleare Ythdc1-Protein als einer der Hauptmediatoren der m6A-Funktionen in D. melanogaster charakterisiert. Zusätzlich zeigte die Untersuchung der m6A-Modifikation während der Fliegenentwicklung eine hohe Menge der Modifikation während der frühen Embryogenese, zu Beginn der Verpuppung sowie in Köpfen und Eierstöcken erwachsener Fliegen auf. Insbesondere ist die m6A-Modifikation für das ordnungsgemäße Funktionieren des Nervensystems erforderlich: Fliegenmutanten ohne Mettl3 oder Mettl14 sind flugunfähig und zeigen schwere Bewegungsdefekte. Der Verlust des nuklearen Ythdc1-Proteins ähnelt dem Verlust von m6A-Schreiberkomponenten in diesem Phänotyp.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5570
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-892a352f-9035-4983-a55e-ae070c21f94f5
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/?language=en
Extent:	XIV, 271 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen