Authors:	Goretzki, Benedikt
Title:	Interactions of the ion channel TRPV4 with regulatory lipids and proteins - An (un)structural study
Online publication date:	28-Jan-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) is a polymodal eukaryotic cation channel that acts as a transducer of mechanical and osmotic stress, temperature, and pain in multiple human tissues. TRPV4 is regulated by a remarkably diverse spectrum of interaction partners to maintain cellular homeostasis. Perturbances in these regulatory pathways, e.g. through mutations in TRPV4, have been implicated with various sensory and motor neuropathies. For TRPV4 to react to temperature and osmotic stress stimuli, the lipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) needs to interact with the TRPV4 phosphoinositide binding domain (PBD). The channel’s sensitivity for temperature and osmotic stress decreases when the F-BAR domain protein Pacsin3 binds with its SH3 domain to a proline-rich region (PRR) in the proximity of the PBD. PRR and the PBD are both located in a ~150 residue region preceding an ankyrin repeat domain (ARD) in the cytosolic TRPV4 N-terminus. This region is missing in the currently available high-resolution structure of a full-length TRPV4 channel. Sequence analyses predict it to be an intrinsically disordered region (IDR). Due to the lack of structural information, the molecular mechanism underlying the PIP2- and Pacsin3-mediated regulation of TRPV4 remains enigmatic. The results of this thesis provide detailed insights into the structural dynamics of a hitherto uncharacterized region of TRPV4 and how it interacts with channel modulators. A structural and dynamic coupling be-tween ARD and IDR emerges as the mechanistic basis for sensing ligand-binding in the IDR in the remaining channel regions. The binding partners PIP2 and Pacsin3 may induce counteracting IDR conformations with opposing effects on the ARD/IDR interaction. PIP2 binding to the PBD leads to an IDR association with the plasma membrane, thereby sensitizing TRPV4. In contrast, Pacsin3 binding to the PRR stabilizes a conformation that tilts the IDR into the cytosol. An exclusive IDR-interaction of PIP2 or Pacsin3 appears as an explanation of the antagonistic relationship between both channel modulators. Beyond the PIP2/Pacsin3 mediated regulation of TRPV4, the ARD/IDR communication may link other events in the IDR such as post-translational modifications or channelopathy-mutations to the functional state of the channel. The ARD/IDR communication, thus, forms the basis for a novel mechanism that may explain how the intrinsically unfolded N-terminus in a physiologically important TRP vanilloid member can regulate its channel activity. Small-angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy combined with hydrogen/deuterium-exchange (HDX-MS) and chemical cross-linking mass spectrometry (XL-MS) re-veal that the entirely disordered IDR is structurally and dynamically coupled to the ARD. In contrast to the expectations based on high-resolution structures of the isolated ARD, this a-helical domain is a comparably labile protein in solution and seems to adopt transiently unfolded states. In the context of the NTD, the ARD becomes structurally and dynamically stabilized through an interaction with the IDR. Strikingly, the PBD seems to contribute to the IDR-ARD communication and may thus link the dynamics in the ARD to a PBD/PIP2 interaction and potentially to Pacsin3 binding to the PRR. NMR and fluorescence spectroscopy revealed that the PBD is generally capable of binding anionic lipids and that regions beyond the PBD interact with PIP2 and other anionic lipids, even though with a lower affinity. This observation indicates that the IDR will be associated with the plasma membrane in the sensitized state of TRPV4, therefore enabling the PBD to bind to a PIP2 lipid. NMR spectroscopy was further used to characterize the Pacsin3 SH3 domain’s interaction with the TRPV4 PRR and the putative cross-talk with the PBD/PIP2 interaction. Competitive binding experiments show that the Pacsin3 SH3 domain and PIP2 can bind to their binding sites in the IDR simultaneously. A solution NMR structure of the Pacsin3 SH3 domain in complex with the TRPV4 PRR reveals that Pacsin3 binding requires a proline trans to cis isomerization in the PRR. This isomerization reorients the PRR and presumably rearranges the preceding IDR. Pacsin3 may antagonize the effects of PIP2 on TRPV4 by stabilizing an IDR conformation where the PBD loses contact with a PIP2 molecule in the plasma membrane. Structural analyses of full-length Pacsin3 via SAXS, X-ray crystallography, NMR, and XL-MS suggest that an F-BAR/SH3 domain interaction maintains Pacsin3 in a compact, putatively auto-inhibited, conformation in the absence of a substrate. The binding of the TRPV4 PRR releases the SH3 domain from the F-BAR domain and presumably activates Pacsin3, thus leading to F-BAR domain-induced membrane curvate. Thus, the regulation of TRPV4 by PIP2 and Pacsin3 appears to be governed by structural rearrangements in the participating protein interaction partners. Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) ist ein polymodaler eukaryotischer Kationenkanal, der als Rezeptor von mechanischem und osmotischem Stress, Temperatur und Schmerz in mehreren menschlichen Geweben fungiert. TRPV4 wird durch ein bemerkenswert vielfältiges Spektrum von Interaktionspartnern reguliert, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Störungen dieser Regulationswege, z.B. durch Mutationen in TRPV4, sind mit verschiedenen sensorischen und motorischen Neuropathien in Verbindung ge-bracht worden. Damit TRPV4 auf Temperatur und osmotischen Stress reagieren kann, muss das Lipid Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) mit der TRPV4-Phosphoinositid-Bindungedomäne (PBD) interagieren. Die Sensitivität für Temperatur und osmotischen Stress nimmt ab, wenn das F-BAR-Domänenprotein Pacsin3 mit seiner SH3-Domäne an eine prolinreiche Region (PRR) in der Nähe der PBD bindet. Die PRR und die PBD befinden sich beide in einer ~150 Aminosäuren umfassenden Region vor einer Ankyrin-Repeat-Domäne (ARD) im zytosolischen TRPV4 N-Terminus. Diese Region ist in der gegenwärtig verfügbaren hochauflösen-den Struktur des TRPV4-Kanals nicht enthalten. Sequenzanalysen sagen voraus, dass es sich um eine intrinsisch ungeordnete Region (IDR) handelt. Aufgrund des Mangels an strukturellen Informationen bleibt der molekulare Mechanismus, der der PIP2- und Pacsin3-vermittelten Regulation von TRPV4 zugrunde liegt, ungeklärt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben detaillierte Einblicke in die Strukturdynamik einer bisher nicht charakterisierten Region des TRPV4 Kanals und wie sie mit Regulatoren interagiert. Eine strukturelle und dynamische Kopplung zwischen ARD und IDR erweist sich als die mechanistische Grundlage für die Erfassung von Ligandenbindung in der IDR in den übrigen Kanalregionen. Die Bindungspartner PIP2 und Pacsin3 können womöglich gegenläufige IDR-Konformationen mit gegensätzlichen Auswirkungen auf die ARD/IDR-Interaktion bewirken. Die PIP2-Bindung an die PBD führt zu einer IDR-Assoziation mit der Plasmamembran, wodurch TRPV4 sensibilisiert wird. Im Gegensatz dazu stabilisiert die Pacsin3-Bindung an die PRR eine Kon-formation, die die IDR in das Zytosol kippt. Eine exklusive IDR-Interaktion von PIP2 oder Pacsin3 erscheint als eine Erklärung für die antagonistische Beziehung zwischen den beiden Kanalmodulatoren. Über die PIP2/Pacsin3-vermittelte Regulierung von TRPV4 hinaus kann die ARD/IDR-Kommunikation vermutlich auch andere Ereignisse in der IDR, wie posttranslationale Modifikationen oder krankheitsauslösende Mutatio-nen, mit dem Funktionszustand des Kanals verknüpfen. Die ARD/IDR-Kommunikation bildet somit die Grundlage für einen neuartigen Mechanismus, der erklären könnte, wie der intrinsisch ungefaltete N-Terminus in einem physiologisch wichtigen TRP-Vanilloid-Mitglied dessen Kanalaktivität regulieren kann. Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) kombiniert mit Wasserstoff/Deuterium-Austausch Massenspektrometrie (HDX-MS) sowie chemischer Quervernetzung gekoppelt mit Massenspektrometrie (XL-MS) zeigen, dass die völlig ungeordnete IDR strukturell und dynamisch an die ARD gekoppelt ist. Entgegen den Erwartungen von hochauflösenden Strukturen ist die isolierte ARD ein vergleichsweise labiles Protein in Lösung und scheint transient entfaltete Zustände anzunehmen. Im Kontext der NTD wird die ARD durch eine Interaktion mit der IDR strukturell und dynamisch stabilisiert. Auffälligerweise scheint die PBD zur IDR-ARD-Kommunikation beizutragen und könnte so die Dynamik in der ARD mit einer PBD/PIP2-Interaktion und möglicherweise auch mit Pacsin3 verknüpfen. Mittels NMR und Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die PBD generell in der Lage ist, anionische Lipi-de zu binden, und dass Regionen jenseits der PBD mit PIP2 und anderen anionischen Lipiden interagieren, wenn auch mit einer geringeren Affinität. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die IDR im sensitivierten Zustand von TRPV4 mit der Plasmamembran assoziiert, so dass die PBD an ein PIP2-Lipid binden kann. NMR-Spektroskopie wurde weiterhin verwendet, um die Wechselwirkung der Pacsin3-SH3-Domäne mit der TRPV4-PRR und eine mögliche Überschneidung mit der PBD/PIP2-Interaktion zu charakterisieren. Kompetitive Bindungsexperimente zeigen, dass die Pacsin3-SH3-Domäne und PIP2 gleichzeitig an ihre Bindungsstellen in der IDR binden können. Durch die Bestimmung einer NMR-Struktur der Pacsin3-SH3-Domäne im Komplex mit der TRPV4-PRR konnte gezeigt werden, dass die Pacsin3-Bindung eine trans-zu-cis-Prolinisomerisierung in der PRR erfordert. Diese Isomerisierung richtet die PRR neu aus und ordnet vermutlich die vorhergehende IDR um. Pacsin3 kann womöglich die Sensitivierung von TRPV4 durch PIP2 antago-nisieren, indem es eine IDR-Konformation stabilisiert, bei der die PBD den Kontakt mit einem PIP2-Molekül in der Plasmamembran verliert. Die Strukturanalyse des Volllänge Pacsin3 Proteins mittels SAXS, Röntgen-kristallographie, NMR und XL-MS lässt vermuten, dass eine F-BAR/SH3-Domänen-Wechselwirkung Pacsin3 in Abwesenheit eines Substrats in einer kompakten, womöglich autoinhibierten Konformation hält. Die Bindung der TRPV4-PRR setzt die SH3-Domäne aus der F-BAR-Domäne frei und aktiviert Pacsin3, sodass die F-BAR domäne Membrankrümmung induzieren kann. Somit scheint die Regulation von TRPV4 durch Pacsin3 durch strukturelle Umlagerungen in beiden Interaktionspartnern bestimmt zu werden.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch. MaxPlanck GraduateCenter
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5562
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-2e94a61d-0345-4da6-afc6-6e74be5702112
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/?language=en
Extent:	v, 283 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen