Authors:	Auber, Martin
Title:	Auswirkungen kontaminierter Medium-Zusätze auf die quantitative microRNA-Analyse oligodenroglialer extrazellulärer Vesikel
Online publication date:	17-Dec-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Im zentralen Nervensystem werden Neurone von oligodendroglialen Myelinscheiden umschlossen, welche maßgeblich für das Aufrechterhalten neuronaler Integrität und das Bereitstellen von energiereichen Metaboliten sind. In vitro Studien zeigen darüber hinaus eine an neuronale Aktivität gekoppelte gliale Unterstützung über oligodendrogliale extrazelluläre Vesikel (EV), welche eine erhöhte neuronale Stressresistenz vermitteln. EVs bestehen aus einer schützenden Lipid-Doppelmembran und können ihre aus Proteinen und Nukleinsäuren bestehende Fracht innerhalb eines Organismus zwischen Zellen transportieren. Auch microRNAs (miRNAs), die Teil der posttranskriptionellen Regulation sind, können mittels EVs transferiert werden. Um zellspezifische EV-Analysen durchführen zu können, muss überwiegend auf Zellkultur-Modelle zurückgegriffen werden, wofür seit Dekaden Wachstumsmedien mit Serumszusätzen (z.B. fetales Rinderserum, FBS) verwendet werden. Seren beinhalten Proteine, Vesikel und RNAs, wodurch die Erforschung von EVs und deren Inhalt erschwert wird. Als Alternative fand die Verwendung von Vesikel-depletierten Seren oder serum-freien, chemisch definierten Supplementen, die als RNA , Vesikel- und Partikel-frei gelten, Einzug in Zellkultur-Methoden für Analysen von EVs. In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst festgestellt werden, dass die Validierung eines vorhandenen miRNA-Datensatzes von Oligodendrozyten und entsprechenden EVs ohne Medium-Kontrollen mittels RT-qPCR (quantitativer Echtzeit-PCR) keine relevanten Signifikanzen hervorbrachte. Basierend auf diesen Resultaten sollten oligodendrogliale EV-miRNAs unter vollumfänglicher Integration von serum-freien Medium-Kontrollen erneut auf ihre biologische Relevanz untersucht werden. Hierbei ergaben sich fünf Erkenntnisse, welche bei Nichtberücksichtigung zu Verfälschungen von EV-Ergebnissen führen können und auf Bestandteile der Medium-Kontrolle zurückzuführen sind (1-5): (1) Bei Nanopartikel Tracking Analysen der Medium-Kontrollen nach differentieller Ultrazentrifugation (dUZ) wurden Partikel im Größenbereich von kleinen EVs detektiert. Durch Anwendung von EV-Isolationsmethoden, (2) Größenausschluss-Chromatographie und (3) dUZ wurden miRNAs aus der Medium-Kontrolle aufgereinigt und mittels RT-qPCR und NGS (Sequenzierung der nächsten Generation) nachgewiesen. (4) Zudem war ein Viertel der miRNA-Kontamination aus der Medium-Kontrolle nach RNase-Behandlung (anerkannte Methode zur Analyse von RNAs innerhalb von EVs) weiterhin detektierbar. (5) Des Weiteren konnten Proteine, welche zuvor als EV-Inhalt beschrieben wurden, im Pellet der Medium-Kontrolle nach dUZ detektiert werden. Die beschriebenen Erkenntnisse können EV-Ergebnisse auf verschiedenen Ebenen verfälschen, was eine entsprechende Anpassung der MISEV-Vorgaben (engl. minimal information for studies of extracellular vesicles) nach sich ziehen müsste. Detaillierte Untersuchungen, zur Feststellung des Ursprungs der miRNA-Verunreinigung, deckten miRNA-Kontaminationen bei verschiedenen industriell hergestellten serum-freien Supplementen (B27 und NS21) auf. Mittels individueller Inhaltsstoff-Analysen konnten kommerziell erworbene Katalasen als miRNA-kontaminierte Komponente identifiziert werden. Der Nachweis abundanter miRNAs aus den jeweiligen Ursprungsgeweben der Katalasen, könnte möglicherweise auch andere Forschungsgebiete (z.B. extrazelluläre RNA) beeinflussen. Des Weiteren gelang in der vorliegenden Arbeit die Entwicklung einer in silico durchgeführten Medium-Kontroll-Korrektur, wodurch der Einfluss der miRNA-Kontamination eingedämmt werden konnte. Hierfür wurden 97 % der kontaminierenden miRNA-Reads der Medium-Kontrolle (was zehn miRNAs ausmacht) aus der Analyse ausgeschlossen. Durch einen parallel durchgeführten Ansatz, bei dem EVs ohne (miRNA-kontaminierte) Supplemente isoliert wurden, konnten die in silico Ergebnisse bestätigt werden. Die umfangreiche Beschreibung der miRNA-Kontaminationen in der Medium-Kontrolle waren dementsprechend essentiell für belastbare Analysen oligodendroglialer EV-miRNAs. Zusätzlich kristallisierte sich unter anderem miR-92b-3p als EV-angereichert heraus, die eine mögliche biologische Relevanz haben könnte und bereits als neuroprotektiv beschrieben wurde. In der vorliegenden Arbeit konnten somit nicht nur miRNA-Kontaminationen in sogenannten „chemisch definierten“ Supplementen beschrieben werden, sondern auch Lösungsvorschläge aufgezeigt werden, wie Analysen von biologisch relevanten miRNAs stringent durchgeführt werden können. In the central nervous system, neurons are wrapped by oligodendroglial myelin sheaths, which are essential for the maintenance of neuronal integrity and provide energy-rich metabolites. In addition, in vitro studies also showed a glial support via oligodendroglial extracellular vesicles (EV), which is triggered by neuronal activity and results in an increased neuronal stress resistance. EVs are surrounded by a protective lipid double membrane and transport their protein- and nucleic acids-containing cargo between cells within an organism. MicroRNAs (miRNAs), as a part of post-transcriptional regulation, can also be transferred by EVs. In the past, cell type specific EVs were studied manly in cell culture models using media supplemented with sera (e.g. fetal bovine serum, FBS). Sera contain proteins, vesicles and RNAs, making research on EVs and their cargo more difficult. As an alternative, the use of serum-free, chemically defined supplements (considered RNA-, vesicle- and particle-free), has found its way into cell culture methods for the analysis of EVs. In the present work, oligodendroglial EV-miRNAs were investigated for their biological relevance under full implementation of serum-free medium controls. Five findings have been observed, which could interfere with EV results and which also can be attributed to components of the medium control (1-5): (1) In nanoparticle tracking analysis of medium control after differential ultracentrifugation (dUC), particles in the size range of small EVs were detected. By applying two different EV isolation methods, (2) size exclusion chromatography and (3) dUC, miRNAs were purified from medium control and detected by real-time quantitative PCR and next-generation sequencing. (4) Furthermore, a quarter of the medium control miRNA contamination was still detectable after RNase treatment (common method for analysing RNAs within EVs). (5) Also proteins previously described as EV-cargo could be detected in the medium control pellet after dUZ. Based on the described findings, EV-results could be misinterpreted on various levels, which should lead to a corresponding adaptation of the MISEV-guidelines (minimal information for studies of extracellular vesicles). Detailed investigations to determine the origin of miRNA-contaminations revealed miRNAs in various industrially produced serum-free supplements (B27 and NS21). Individual analysis of ingredients identified commercially acquired catalases as miRNA-contaminated components. Detection of abundant miRNAs from respective origins of catalases could also influence other research areas like extracellular RNA. Furthermore, we developed an in silico performed medium control correction to reduce the influence of miRNA-contaminations on EV-miRNA results. For this purpose, 97 % of the contaminating miRNA-reads in medium control (representing ten miRNAs) were excluded from the analysis. Parallel approaches, in which EVs were isolated without (miRNA-contaminated) supplements, confirmed the in silico results. The comprehensive description of miRNA contaminations in medium control were essential for a reliable analysis of oligodendroglial EV-miRNAs. Additionally, miR-92b-3p turned out to be enriched in EV-pellets, which might have a possible biological relevance, as miR-92b-3p has already been described as neuroprotective. In the present work, not only miRNA-contaminations in so-called "chemically defined" supplements were found, also solutions for stringent and rigorous analysis of biologically relevant miRNAs could be proposed.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5502
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-4e36c903-6b70-4d54-a674-5e91f7141f044
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-ND
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/deed.en
Extent:	XVII, 116, xv Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen