Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-5420
Authors: Werner, Anke
Title: Die Bedeutung von Aminosäuretransportern und endogener Synthese für die Bereitstellung von Arginin in humanen T-Lymphozyten und chronischen lymphatischen Leukämiezellen
Online publication date: 8-Dec-2020
Language: german
Abstract: Die kationische Aminosäure Arginin ist als Proteinbaustein und Vorstufe von Signalmolekülen für alle Zellen in unserem Körper unentbehrlich. In Tumoren oder entzündlichen Geweben herrscht jedoch durch die Akkumulation Arginase-exprimierender myeloider Zellen Argininmangel, weshalb die Proliferation und Zytokin-Sekretion von T-Lymphozyten in dieser Umgebung stark eingeschränkt ist. Demnach spielt die Aufnahme von Arginin für die adäquate T-Zellfunktion eine unverzichtbare Rolle. Trotzdem war der verantwortliche Transporter bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Identifizierung des kationischen Aminosäuretransporter-1 (hCAT-1) als hauptverantwortlichen Arginintransporter in primären humanen T-Lymphozyten. Transporter-Expressionsanalysen zeigten eine starke Expression des hCAT-1 in anti-CD3/anti-CD28-stimulierten T-Zellen. Zwei weitere Arginin-akzeptierende Transporter waren ebenfalls exprimiert, jedoch stimulationsunabhängig. In aktivierten T-Lymphozyten wurde ein starker CAT-charakteristischer Arginintransport festgestellt. Die signifikant reduzierte Argininaufnahme nach siRNA-vermittelter Hemmung der hCAT-1-Expression bestätigte schließlich diesen Transporter als hauptverantwortlichen Arginintransporter in stimulierten T-Lymphozyten. Vergleichbar mit der Inkubation unter Argininmangel resultierte die Senkung des Argininimports in der ausgeprägten Reduktion der Proliferation dieser Immunzellen. Die hCAT-1-vermittelte Argininaufnahme ist demnach als Schlüsselelement für die adäquate T-Zellfunktion zu betrachten. Ergänzend dazu wurde gezeigt, dass humane T-Lymphozyten, neben der Aufnahme von extrazellulärem Arginin, diese Aminosäure für die Aufrechterhaltung der Zellproliferation auch intrazellulär über die Harnstoffenzyme Argininosuccinatlyase und Argininosuccinatsynthetase (ASS) aus der neutralen Aminosäure Citrullin synthetisieren können. Vorrausetzung dafür ist jedoch die Anwesenheit geringer Mengen extrazellulären Arginins. Ausschließlich unter dieser Bedingung zeigten HPLC-Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit die intrazelluläre Zunahme der Aminosäure Arginin nach Inkubation dieser Immunzellen mit 1 mM Citrullin. Erklärt werden können diese Ergebnisse durch Untersuchungen der Arbeitsgruppe Munder (3. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität, Mainz), die in der Gegenwart geringer Argininkonzentrationen, nicht jedoch unter vollständigem Argininmangel, die maximale ASS-Protein-Expression in stimulierten T-Zellen feststellte. Welcher Transporter für die Aufnahme von Citrullin in humanen T-Lymphozyten verantwortlich ist, war unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der System L-Transporter LAT1 als hauptverantwortlicher Citrullintransporter in stimulierten humanen T-Zellen identifiziert. Die Expression dieses Transporters war in aktivierten T-Lymphozyten in der Gegenwart von 1000 und 20 µM Arginin im Vergleich zu unter vollständigem Argininmangel am stärksten. Dies wurde ebenso für den als System L-spezifisch charakterisierten Citrullinimport festgestellt. Die Reduktion der Citrullinaufnahme nach siRNA-vermittelter Senkung der LAT1-Expression bestätigte diesen Transporter als Haupt-Citrullinimporteur in humanen T-Lymphozyten. Zusammenfassend wurde demnach im zweiten Teil dieser Arbeit gezeigt, dass durch die LAT1-vermittelte Citrullinaufnahme die Proliferation humaner T-Zellen auch in Arginin-depletierten Tumorgeweben möglich ist. Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) kann bis heute mit konventionellen Therapieansätzen nicht geheilt werden. Argininmangel wird aktuell als die Achillesferse von Tumorzellen diskutiert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass auch die Proliferation und Viabilität humaner CLL-Zellen argininabhängig sind. In primären CLL-Zellen war die ASS nicht exprimiert, demnach diese Zellen, aufgrund der fehlenden intrazellulären Argininsynthese, im Gegensatz zu humanen T-Lymphozyten, Arginin-auxotroph sind. Durch Transporter-Expressionsanalysen, [3H]Arginin-Aufnahmestudien und shRNA-vermittelte Reduktion des hCAT-1 wurde dieser Transporter auch in CLL-Zellen als Haupteintrittspforte für Arginin identifiziert. Die shRNA-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Expression resultierte in diesen Leukämiezellen in der vollständigen Inhibition der Proliferation in vitro und Verlangsamung des Tumorwachstums in CLL-Xenograftmodellen. Zusammenfassend ist das Ergebnis dieser Arbeit die Ausarbeitung einer neuen vielversprechenden Therapiestrategie für die CLL und andere Arginin-auxotrophe Tumore. Dieses Konzept beruht auf der Induktion eines intrazellulären Argininmangels durch die gezielte Hemmung des verantwortlichen Arginintransporters hCAT-1 bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Proliferation von Tumor-bekämpfenden T-Lymphozyten durch die intrazelluläre Argininsynthese in der Gegenwart der neutralen Aminosäure Citrullin. The cationic amino acid arginine is a building block of proteins and a precursor of signal molecules and therefore indispensable for every cell in our body. However, due the accumulation of arginase-expressing myeloid cells, tumors and inflammatory tissues are depleted of arginine. Under this condition, T cell proliferation and cytokine secretion are strongly restricted. Hence, the uptake of extracellular arginine must be crucial for efficient T cell function. However, the responsible arginine transporter was unknown so far. In this thesis, the human cationic amino acid transporter 1 (hCAT-1) has been identified as mainly responsible for arginine transport in primary human T lymphocytes. Transporter expression analysis showed a strong induction of hCAT-1 in anti-CD3/anti-CD28-stimulated T lymphocytes. Only two other arginine-accepting transporters were expressed, but they were not induced upon stimulation. Activated T cells exhibited strongly increased arginine transport, which was distinguished as characteristic for CATs. The substantially reduced arginine uptake after siRNA-mediated down-regulation of hCAT-1 expression confirmed this transporter as primarily responsible for arginine import in stimulated T lymphocytes. Comparable with arginine starvation, the lowering of arginine import provoked a strong reduction in the proliferation of these immune cells. We can thus conclude, that the hCAT-1-mediated arginine uptake is a key component for efficient T cell function. Additionally, the intracellular synthesis of arginine from the neutral amino acid citrulline via the urea cycle enzymes argininosuccinate lyase and argininosuccinate synthetase (ASS) to maintain T cell proliferation was shown in collaboration with the group of Markus Munder (3. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg Universität, Mainz). The requirement for this is the presence of small quantities of extracellular arginine. Exclusively under this condition, HPLC analyses revealed the enhancement of intracellular arginine in T cells, incubated with 1 mM citrulline. This could be explained by studies, performed by the group of Markus Munder (3. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg Universität, Mainz), which showed a maximum of ASS protein expression in the presence of low arginine concentrations, but not upon complete arginine depletion. The transporter, responsible for citrulline import in human T lymphocytes was unknown so far. In this thesis the system L transporter LAT1 was identified as primarily responsible citrulline transporter in stimulated human T cells. LAT1 expressions was strongest in T lymphocytes, incubated in the presence of 1000 and 20 µM arginine, compared to complete arginine depletion. This was also true for the citrulline transport in these cells, which exhibited system L-specific characteristics. Finally, the lowering of citrulline uptake after siRNA-mediated reduction of LAT1 expression, confirmed this transporter as primarily responsible for citrulline import in stimulated human T cells. In summary, the second part of this thesis showed the potential of human T cells to proliferate also in arginine-depleted tumor tissues by the means of LAT1-mediated citrulline uptake. Until today, chronic lymphocytic leukemia (CLL) is incurable by conventional treatment strategies. Arginine starvation is currently discussed as the Achilles heel of tumor cell growth. In the third part of this thesis, the proliferation and viability of human CLL cells were shown to be dependent on arginine. In primary CLL cells ASS was not expressed, thus intracellular arginine synthesis is not possible in these cells. This defines primary CLL cells, in contrast to human T cells, as arginine auxotrophic. By the analyses of transporter expression, [3H]arginine uptake studies and the shRNA-mediated reduction of hCAT-1 expression, this transporter was identified as the main port of entry for arginine also in human CLL cells. In these leukemia cells the shRNA-mediated reduction of hCAT-1 expression resulted in the complete inhibition of proliferation in vitro and the delay of tumor growth in CLL xenograft models. In summary, this work revealed a new promising target for CLL treatment and other arginine auxotrophic tumors. This concept is based on an induction of intracellular arginine starvation by the selective inhibition of the arginine transporter hCAT-1, and a simultaneous maintenance of tumor fighting T cell proliferation via intracellular arginine synthesis in the presence of the neutral amino acid citrulline.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5420
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-0ad920d0-ca00-4268-80d5-44714c12646a4
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: CC BY
Information on rights of use: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.en
Extent: XIII, 206 Seiten
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
werner_anke-die_bedeutung_-20201128170324353.pdf2.51 MBAdobe PDFView/Open