Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-5352
Authors: Cipińska, Marta
Title: Development of a novel translocation reporter system
Online publication date: 18-Nov-2020
Language: english
Abstract: Genome integrity is vital for the propagation of genetic information. However, genomes are under the constant exposure to DNA damaging factors. One of the most deleterious types of DNA damage are DSBs. Illegitimate repair of broken chromosomes may result in the formation of chromosome rearrangements, including chromosome translocations. Their occurrence may lead to the deregulation of gene expression or activation of oncogenes that can be causal in a variety of cancers. The formation of chromosome translocations is a multistep process that involves the chromosome breakage, chromosome-end synapsis and misrepair to form fusions. However, still little is known about the factors that contribute to those individual steps. Due to their rare occurrence, probing and quantifying chromosome translocations is difficult. Current tools, such as FISH and PCR are laborious and not sensitive enough for such low-frequency events. The major focus of the field has been to understand the repair mechanisms and studying the characteristics of individual factors. The purpose of this study was to develop the system that would enable the identification of novel factors involved in the formation of chromosome translocations through performing a genome-wide screening. Created translocation reporter assay is based on the CRISPR/Cas9 technology for inducing DSBs, which is a new golden standard for creating translocation relevant cancer models. In addition, the custom-made selection cassette was integrated into the genome of the haploid cell line. It contains the antibiotic resistance gene, which expression is activated only upon translocation. Therefore, the main advantage of the system is that it enables the selection and enrichment of cells positive for translocations. Our results show that the system is suitable for the generation of different types of chromosome rearrangements, such as deletions, inversions and translocations. It is also compatible with PCR based methods, which allows quantification of frequencies of occurring events. We anticipate our assay to be a starting point for more sophisticated studies on the processes behind the translocation biogenesis.
Die Integrität des Genoms ist für die Vermehrung der genetischen Information von entscheidender Bedeutung. Allerdings sind Genome ständig schädlichen Faktoren ausgesetzt. Eine der gefährlichsten Arten von DNA-Schäden sind DSBs. Illegitime Reparaturen von beschädigten Chromosomen können zur Entstehung von Chromosomen-Rearrangements, einschließlich Chromosomentranslokationen, führen. Ihr Vorkommen kann zur Deregulierung der Genexpression oder zur Aktivierung von Onkogenen führen. Tatsächlich sind Translokationen das Merkmal vieler Krebsarten, psychiatrischer Erkrankungen und Unfruchtbarkeit. Der Prozess der Entstehung von Translokationen ist bekannt und umfasst: den Bruch von Chromosomen, die Migration in den Kernraum, Synapsis und falsche Reparaturen. Über die Faktoren, die zu diesen einzelnen Schritten beitragen, ist jedoch noch wenig bekannt. Aufgrund ihres seltenen Vorkommens ist die Untersuchung und Quantifizierung von Chromosomentranslokationen schwierig. Die derzeitigen Methoden wie FISH und PCR sind aufwendig und nicht empfänglich genug für solche niederfrequenten Vorgänge. Der Schwerpunkt in diesem Gebiet liegt auf dem Verständnis der Reparaturmechanismen und der Untersuchung der Eigenschaften einzelner Einflussfaktoren. Das Ziel dieser Studie war es, ein System zu entwickeln, dass die Identifizierung neuer Faktoren, die an der Bildung von Chromosomentranslokationen beteiligt sind, durch die Durchführung des genomweiten Screenings ermöglicht. Der hergestellte Translokationsreporter-Assay basiert auf der CRISPR/Cas9-Technologie zur Induktion von DSBs, welches einen neuen Goldstandard für die Herstellung von translokationsrelevanter Krebsmodellen ist. Darüber hinaus wurde die maßgeschneiderte Auswahlkassette in das Genom der haploiden Zelllinie integriert. Sie enthält das Antibiotikaresistenzgen, dessen Expression erst bei der Translokation aktiviert wird. Der Hauptvorteil des Systems besteht somit darin, dass es die Auswahl und Anreicherung von Zellen ermöglicht, die für Translokationen positiv sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das System für die Generierung verschiedener Arten von Chromosomen-Rearrangements, wie Deletionen, Inversionen und Translokationen, geeignet ist. Es ist auch mit PCR-basierten Methoden kompatibel, wodurch eine Quantifizierung der Häufigkeit der auftretenden Ereignisse möglich ist. Wir gehen davon aus, dass unser Assay ein Beginn für anspruchsvollere Studien zu den Prozessen im Hintergrund der Translokationsbiogenese sein wird.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5352
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-23cec1e4-07ac-4ec2-a69b-d65f4739ccb72
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/?language=en
Extent: 135 Blätter
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
cipińska_marta-development_of-20201116210331372.pdf3.78 MBAdobe PDFView/Open