Funktionelle Charakterisierung des Proteins DNAJC13 in der Autophagie
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5.1 Zusammenfassung
Die Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase ist für das Überleben eines
Organismus sowie seiner Funktion von entscheidender Bedeutung. Um das Gleichgewicht von Proteinsynthese, -stabilisierung und -abbau zu erhalten, bedient sich die Zelle einem hoch konservierten Qualitätskontrollsystem, welches sich aus molekularen Chaperonen sowie den beiden Protein-Degradationswegen, dem Ubiquitin-Proteasom-System und dem (autophago-) lysosomalen System, zusammensetzt. Während des autophagischen Prozesses werden zytoplasmatische Komponenten von einer vesikulären Doppelmembran, dem Autophagosom, umschlossen; nach seiner Reifung fusioniert das Autophagosom mit dem Lysosom. In letzterem enthaltene Hydrolasen sorgen schließlich für die Degradation der Substrate. Unsere Arbeitsgruppe konnte das bisher mit dem retrograden Transport von endosomalen Vesikeln assoziierte DNAJ/HSP40 Protein DNAJC13 als einen positiven Regulator der Autophagie identifizieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Rolle von DNAJC13 innerhalb des autophagischen Prozesses detaillierter untersucht. Sowohl Lokalisations- als auch Interaktionsstudien zeigten, dass DNAJC13 mit den ATG8-Familienmitgliedern LC3B und GABARAP interagiert.
Generell wird die Interaktion zwischen ATG8-Proteinen und deren Interaktionspartnern
durch das LIR (LC3-interacting region) -Motiv vermittelt. Mit Hilfe eines Peptid Arrays
konnten innerhalb von DNAJC13 vier LIR-Motive identifiziert werden, die spezifisch mit dem ATG8-Protein GABARAP interagieren. Zur Untersuchung der Funktionalität dieser LIRMotive sowie der DNAJ-Domäne von DNAJC13 wurden verschiedene DNJAC13 Mutanten generiert (u.a. DNAJC13-LIR1-4, -TV1-3, -TM, -DNAJ). Die detaillierte Analyse dieser Mutanten ergab, dass Punktmutationen innerhalb von DNAJC13 hinsichtlich ihrer Konformation zu enorm sensiblen und somit destabilisierten Proteinen führten. Punktmutationen innerhalb der DNAJ-Domäne sowie des vierten LIR-Motivs oder die Deletion des vierten LIR-Motivs (DNAJC13-DNAJ, -LIR4 sowie -△LIR4) bewirkten die Aggregation von DNAJC13. Punktmutationen im zweiten oder dritten LIR-Motiv von DNAJC13 sowie die C-terminale Trunkierung von DNAJC13 (DNAJC13-TV1-3) hatten eine Dosis-abhängige Aggregation des Proteins zur Folge. Interessanterweise resultieren andere Punktmutationen in DNAJC13, wie beispielsweise die pathologisch bedeutsame Parkinson-assoziierte N855S-Mutation, nicht in der Aggregation des Proteins. Eine Punktmutation im ersten LIR-Motiv (DNAJC13-LIR1 und -TM) beeinflusste die Assoziation von DNAJC13 mit Membranen; dies lässt auf einen dominanten Effekt des ersten LIR-Motivs (LIR1) auf das Protein und dessen Konformation schließen. Im Zuge der funktionellen Charakterisierung des HSP40 Proteins DNAJC13 konnten im Rahmen dieser Dissertation innerhalb DNAJC13 vier LIR-Motive identifiziert werden. Durch Mutation dieser putativ funktionellen Motive sowie Trunkierungen von DNAJC13 wurden
Mutanten generiert, die eine Analyse der Funktion von DNAJC13 als positiven Regulator der Autophagie erlauben. Die in dieser Arbeit erlangten Resultate werden damit nicht nur zur weiteren detaillierteren Charakterisierung des HSP40 Proteins DNAJC13 selbst, sondern auch zur Aufklärung seiner Rolle im autophagischen Prozess beitragen.