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Authors: Maus, Joanna
Title: Funktionelle Charakterisierung des Proteins DNAJC13 in der Autophagie
Online publication date: 10-Nov-2020
Language: german
Abstract: 5.1 Zusammenfassung Die Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase ist für das Überleben eines Organismus sowie seiner Funktion von entscheidender Bedeutung. Um das Gleichgewicht von Proteinsynthese, -stabilisierung und -abbau zu erhalten, bedient sich die Zelle einem hoch konservierten Qualitätskontrollsystem, welches sich aus molekularen Chaperonen sowie den beiden Protein-Degradationswegen, dem Ubiquitin-Proteasom-System und dem (autophago-) lysosomalen System, zusammensetzt. Während des autophagischen Prozesses werden zytoplasmatische Komponenten von einer vesikulären Doppelmembran, dem Autophagosom, umschlossen; nach seiner Reifung fusioniert das Autophagosom mit dem Lysosom. In letzterem enthaltene Hydrolasen sorgen schließlich für die Degradation der Substrate. Unsere Arbeitsgruppe konnte das bisher mit dem retrograden Transport von endosomalen Vesikeln assoziierte DNAJ/HSP40 Protein DNAJC13 als einen positiven Regulator der Autophagie identifizieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Rolle von DNAJC13 innerhalb des autophagischen Prozesses detaillierter untersucht. Sowohl Lokalisations- als auch Interaktionsstudien zeigten, dass DNAJC13 mit den ATG8-Familienmitgliedern LC3B und GABARAP interagiert. Generell wird die Interaktion zwischen ATG8-Proteinen und deren Interaktionspartnern durch das LIR (LC3-interacting region) -Motiv vermittelt. Mit Hilfe eines Peptid Arrays konnten innerhalb von DNAJC13 vier LIR-Motive identifiziert werden, die spezifisch mit dem ATG8-Protein GABARAP interagieren. Zur Untersuchung der Funktionalität dieser LIRMotive sowie der DNAJ-Domäne von DNAJC13 wurden verschiedene DNJAC13 Mutanten generiert (u.a. DNAJC13-LIR1-4, -TV1-3, -TM, -DNAJ). Die detaillierte Analyse dieser Mutanten ergab, dass Punktmutationen innerhalb von DNAJC13 hinsichtlich ihrer Konformation zu enorm sensiblen und somit destabilisierten Proteinen führten. Punktmutationen innerhalb der DNAJ-Domäne sowie des vierten LIR-Motivs oder die Deletion des vierten LIR-Motivs (DNAJC13-DNAJ, -LIR4 sowie -△LIR4) bewirkten die Aggregation von DNAJC13. Punktmutationen im zweiten oder dritten LIR-Motiv von DNAJC13 sowie die C-terminale Trunkierung von DNAJC13 (DNAJC13-TV1-3) hatten eine Dosis-abhängige Aggregation des Proteins zur Folge. Interessanterweise resultieren andere Punktmutationen in DNAJC13, wie beispielsweise die pathologisch bedeutsame Parkinson-assoziierte N855S-Mutation, nicht in der Aggregation des Proteins. Eine Punktmutation im ersten LIR-Motiv (DNAJC13-LIR1 und -TM) beeinflusste die Assoziation von DNAJC13 mit Membranen; dies lässt auf einen dominanten Effekt des ersten LIR-Motivs (LIR1) auf das Protein und dessen Konformation schließen. Im Zuge der funktionellen Charakterisierung des HSP40 Proteins DNAJC13 konnten im Rahmen dieser Dissertation innerhalb DNAJC13 vier LIR-Motive identifiziert werden. Durch Mutation dieser putativ funktionellen Motive sowie Trunkierungen von DNAJC13 wurden Mutanten generiert, die eine Analyse der Funktion von DNAJC13 als positiven Regulator der Autophagie erlauben. Die in dieser Arbeit erlangten Resultate werden damit nicht nur zur weiteren detaillierteren Charakterisierung des HSP40 Proteins DNAJC13 selbst, sondern auch zur Aufklärung seiner Rolle im autophagischen Prozess beitragen.
5.2 Summary The maintenance of cellular protein homeostasis is of vital importance for the survival of an organism and its cellular function. To maintain the balance of protein synthesis, stabilization, and degradation, cells are equipped with a highly conserved quality control system consisting of molecular chaperones as well as two protein degradation pathways: the ubiquitinproteasome system and the (autophago-) lysosomal system. During the autophagic process, cytoplasmic components are engulfed by a vesicular double membrane, the so-called autophagosome. The mature autophagosome fuses with the lysosome and its content is subsequently degraded by lysosomal hydrolases. Our group identified the DNAJ/HSP40 protein DNAJC13 which was previously described in the retrograde transport of endosomal vesicles, as a positive regulator of autophagy. In the present study, the role of DNAJC13 within the autophagic process was investigated in more detail. Localization as well as interaction studies revealed that DNAJC13 interacts with the ATG8 family members LC3B and GABARAP. In general, the interaction between ATG8 proteins and their interaction partners is mediated by the LIR (LC3-interacting region) motif. Using a peptide array, four LIR motifs within DNAJC13 were identified which specifically interact with the ATG8 protein GABARAP. In order to study the functionality of these LIR motifs and the DNAJ domain of DNAJC13, various DNJAC13 mutants were generated (including DNAJC13-LIR1-4, -TV1-3, -TM, -DNAJ). Detailed analysis of these mutants revealed that point mutations within DNAJC13 led to a highly sensitive and thus destabilized protein conformation. Point mutations in the DNAJ domain or in the fourth LIR motif as well as the deletion of the fourth LIR motif (DNAJC13-DNAJ, -LIR4 and - △ LIR4) caused the aggregation of DNAJC13. Point mutations in the second or third LIR motif of DNAJC13 as well as the truncation of its C-terminus (DNAJC13-TV1-3) resulted in a dose-dependent aggregation of the protein. Interestingly, other point mutations in DNAJC13, such as the pathologically significant Parkinson-associated N855S mutation, did not result in the aggregation of the protein. A point mutation in the first LIR motif (DNAJC13-LIR1 and -TM) negatively influenced the association of DNAJC13 with membranes which suggests a dominant effect of the first LIR motif (LIR1) on protein conformation. In the course of the functional characterization of the HSP40 protein DNAJC13, four LIR motifs of DNAJC13 could be identified. Analysis of the mutation or truncation of these putative functional motifs led to a deeper understanding of the role of DNAJC13 as a positive regulator of autophagy. The results obtained in this study contribute not only to further characterization of the HSP40 protein DNAJC13, but also to the elucidation of its role in the autophagic process.
DDC: 000 Allgemeines
000 Generalities
500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5298
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: CC-BY-NC-ND
Information on rights of use: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
Extent: 142 Seiten
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