Authors:	Shah, Viral Virendra
Title:	Enhancing PARP inhibition mediated DNA Damage and leveraging inherent anti-apoptotic dependencies in acute myeloid leukemia
Online publication date:	13-Nov-2020
Year of first publication:	2020
Language:	english
Abstract:	The Poly (ADP-ribose) polymerase protein family plays an important role in genome maintenance, with a major function in the correction of single strand breaks (SSB) via the base excision repair pathway. The significance of PARP inhibition and its potential for achieving synthetic lethality have been extensively characterized for cancers with germline BRCA mutations. The knowledge incurred from these cancer models has already been applied to various other cancer models such as glioblastoma, prostrate, and ovarian cancers. Although BRCA mutations are not amongst the major cluster of driver mutations, some reports have shown a hypermethylation of BRCA in acute myeloid leukemia (AML) patient samples suggesting dysfunctional DNA repair remains an untapped territory in targeting vulnerabilities of cancer cells. AML is characterized by an increased cell proliferation, blocked differentiation, and aberrant self-renewal capabilities. In this project, we raised the hypothesis that further induction of replicative stress / DNA damage mediated by PARP inhibition in already highly proliferating cells potentiates the dependency on anti-apoptotic proteins and that a specific inhibition of anti-apoptotic pathways will cause cell death. Preliminary data showed that mono-treatment with a PARP 1/2 inhibitor (Olaparib) induced a dose- and time dependent accumulation of gH2AX foci. Olaparib neither affected the survival of the cells nor cell cycle progression. We next investigated if the damage was cell cycle specific. To this end, we used high-content screening approach quantifying the DNA damage within each phase of the cell cycle. DNA damage accumulation was elevated in S/G2 phase, but cells managed to overcome this stress and continued cycling. Interestingly, the increase in DNA damage was accompanied by a dose-dependent increase in the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma 2 (BCL2). We performed unsupervised hierarchal clustering of endogenous transcriptomic profiles of genes involved in DNA damage response pathways of various AML cell lines with distinct genetic background and correlated these profiles with the mutational status of major regulators of DNA damage. We observed that cell lines with wild type (wt) TP53 expression clustered together, and a subgroup of the cluster had FLT3 mutations. v Consistently, when we combined PARP inhibition together with BCL2 inhibitor (Venetoclax) in a TP53wt FLT3mut background, cells underwent synergistic apoptotic death. Of note, although the combined treatment was most effective in cells with low or even undetectable BRCA1 or BRCA2 protein expression, cell lines with BRCA1 and BRCA2 expression also showed promising responses. Our data indicate that inhibition of DNA damage repair in combination with inhibition of antiapoptotic pathways may provide a novel treatment strategy in highly proliferative cancers. Die Proteinfamilie der Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen spielt eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität. Eine Hauptfunktion der Mitglieder dieser Familie liegt in der Reparatur von Einzelstrangbrüchen (SSB) mittels Basenexzisionsreparatur (BER). Die Bedeutung der PARP-Hemmung zur Induktion synthetischer Letalität wurde erstmals für Patienten mit Mammakarzinom mit Keimbahnmutationen in den BRCA-Genen bzw. für HER2-negative Mas gezeigt. Die in diesen Krebsmodellen gewonnenen Erkenntnisse wurden bereits erfolgreich auf andere Tumorentitäten, wie z.B. Glioblastome, Prostatakarzinom sowie Eierstockkrebs übertragen. Obwohl BRCA-Mutationen nicht zu den hauptursächlichen Treibermutationen in der akuten myeloischen Leukämie (AML) gehören, wurde bei einigen Patienten eine Hypermethylierung der BRCA-Gene beschrieben. Dies legt den Schluss nahe, dass es bei diesen Patienten zu einer Deregulation der DNA-Reparatur (DDR) kommen kann. Dies eröffnet neue, bisher nicht angewandte Therapieoptionen in der Behandlung der AML. Die AML ist charakterisiert durch eine erhöhte Proliferationsrate, sowie einen Differenzierungsblock und der deregulierten Fähigkeit zur Selbsterneuerung myeloischer Zellen. In dieser Arbeit stellen wir daher die Frage, inwieweit eine weitere Erhöhung des replikativen Stresses sowie der DNA-Schäden durch PARP Inhibition in bereits stark proliferierenden Zellen die Anhängigkeit dieser von anti-apoptotischen Proteinen erhöht. Des Weiteren wollen wir feststellen, ob spezifische Inhibition von anti-apoptotischen Signalwegen Zelltod auslösen kann. Erste Daten haben gezeigt, dass die Monobehandlung mit dem PARP1/2 Inhibitor Olaparib eine dosis- und zeitabhängige Anhäufung von gH2AX-Foci zu dem Folgen hat. Olaparib hat keinen Effekt auf das Überleben der Zellen sowie den Zellzyklus. Im Weiteren stellten wir die Frage, ob die DNA-Schädigung zellzyklusspezifisch ist. Zu diesem Zweck verwendeten wir „High-content screening“ um die DNA-Schädigung zellzyklusabhängig zu quantifizieren. Wir konnten eine Akkumulation der DNA-Schäden in der S/G2-Phase beobachten; diese Schädigung konnte allerdings von den Zellen vii überwunden und eine Rückkehr zum normalen Zellzyklus beobachtet werden. Interessanterweise wurden erhöhte DNA-Schäden von einer erhöhten, dosis-abhängigen Expression des anti-apoptotischen Proteins „protein B-cell lymphoma 2“ (BCL2) begleitet. Wir haben „Unsupervised Hierarchal-clustering von endogenen Transkriptomprofilen verschiedener, in der DDR involvierten Gene mehrerer AML Zelllinien durchgeführt, die sich durch verschiedene genetische Hintergründe auszeichnen. Anschließend wurden die jeweiligen Profile mit dem Mutationsstatus verschiedener DDR-Regulatorgene korreliert. Wir konnten zeigen, dass Zelllinien mit wildtypischem (wt) TP53 ein Cluster bilden, sowie auch Zellen mit FLT3-Mutation eine Untergruppe. Wurden Zellen mit TP53wt FLT3mut Status mit einer Kombinationstherapie aus PARP-Inhibitor und BCL2-Inhibitor (Venetoclax) behandelt, konnte in dieser Apoptose ausgelöst werden. Dieser Zelltod basierte auf der synergistischen Wirkung beider Inhibitoren. Von Interesse ist die Tatsache, dass, obwohl die Kombinationsbehandlung am effektivsten in Zellen mit geringer oder keiner BRCA1 oder BRCA2 Expression waren, auch in Zellen mit BRCA1 oder BRCA2 Expression vielversprechende Ergebnisse gewonnen werden konnten. Unsere Daten zeigen, dass die gezielte Inhibition von DANN-Reparaturwegen in Kombination mit der Hemmung von anti-apoptototischen Signalwegen eine neue Therapieoption in hochproliferativen Krebszellen darstellen kann. Derzeit untersuchen wir die kombinatorischen Effekte dieser Therapie in primären AML Proben und beschäftigen uns mit den Mechanismen mittels derer AML Zellen DANN-Schäden begegnen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5288
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-3e1bf18c-9897-499c-bbd3-3c41621392ae2
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xiii, 127 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen