Authors:	Pillitteri, Daniele
Title:	Funktionelle und zellbiologische Untersuchungen von genetisch determinierten Thrombozytopathien
Online publication date:	15-Dec-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Die Charakterisierung von Thrombozyten-Defekten bei Patienten mit Verdacht auf hereditären Thrombozytopathien stand im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. Hauptziel war ein besseres Verständnis von familiär bedingten und GPIIb-IIIa-abhängigen Thrombozyten-Dysfunktionen, der genetischen Ursachen und deren Auswirkungen auf die Blutungsneigung zu gewinnen. Zudem wurde der Einfluss von Kombinationen von heterozygoten Varianten in Genen, die für den GPIIb-IIIa-Rezeptor und für Proteine der Signaltransduktion oder Granula-Sekretion kodieren, auf die Thrombozytenfunktion und auf den Schweregrad der Blutungsneigung untersucht. Es wurden die Lichttransmissionsaggregometrie und Durchflusszytometrie verwendet, um Aktivierungsgrad und Aktivierbarkeit der Thrombozyten bezüglich Aggregation, in vitro Aktivierungskapazität von GPIIb-IIIa, Oberflächen-Rezeptoren (CD42b, CD42a, CD36, GPVI) sowie die aktivierungsabhängige Granula-Exozytose und Sekretion der Granulainhaltstoffe zu untersuchen. Des Weiteren wurden molekulargenetische Verfahren (Whole Exome Sequencing und Sanger Sequenzierung) eingesetzt, um neue pathogene Varianten im Exom bei Patienten mit Thrombozytopathien zu identifizieren. Es wurden Patienten mit Verdacht auf Glanzmann Thrombasthenie (GT) untersucht. In dem untersuchten Patientenkollektiv wurden 7 verschiedene Mutationen im ITGA2B- und ITGB3-Gen in insgesamt 6 Patienten identifiziert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen zum ersten Mal bei Patienten mit GT eine Erhöhung der thrombozytären CD63-Expression nach Aktivierung mit Thrombin. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte sein, dass aufgrund des fehlenden bzw. verminderten Gehalts an GPIIb-IIIa und des damit einhergehenden geringeren crowding-Effekts, CD63 vermehrt in die unbesetzten Bereiche der Plasmamembran inseriert werden kann. Dieses Ergebnis eröffnet einen neuen Ansatzpunkt zum Verständnis von möglichen kompensatorischen Aktivierungsmechanismen bei hereditären Thrombozyten-Funktionsstörungen. Des Weiteren wurden in dieser Dissertation 2 Kinder (SPD-1-Index und SPD-2-Index) mit ausgeprägter Blutungsneigung (ISTH-BAT Blutungsscore: 6) untersucht inkl. Familienangehörige. Bei dem Patienten SPD-1-Index wurde eine Sequenzvariante im ITGB3-Gen identifiziert (c.2221T>C; p.Trp741Arg), die sich phänotypisch in einer 50%-igen Expression des GPIIb-IIIa-Rezeptors und einer gestörten in vitro Aktivierungskapazität von GPIIb-IIIa zeigt. Zudem wurde bei diesem Patienten eine heterozygote Variante im TUBB1-Gen (c.862G>A; p.E288K Substitution) nachgewiesen, die vorbeschrieben ist und als pathogen mit unklarer Signifikanz klassifiziert ist. Zusätzlich wurde eine pathologische Exozytose aller 3 Granula-Typen mit verminderter Expression von P-Selektin, LAMP-3 und LAMP-1 nachgewiesen. Ursächlich für die gestörte Freisetzungsreaktion könnte das mittels Immunofluoreszenzmikroskopie nachgewiesene pathologisch veränderte β1-Tubulin sein. Allerdings führte das alleinige Vorhandensein der heterozygoten TUBB1-Variante beim asymptomatischen Vater zu keiner Granulafreisetzungsstörung und zu keiner GPIIb-IIIa-Aktivierungsstörung, sodass sich schlussfolgern lässt, dass wahrscheinlich nur die Kombination der beiden heterozygoten Varianten zu einer relevanten Thrombozytenstörung mit erhöhter Blutungsneigung führt. Bei der Patientin SPD-2-Index wurde eine heterozygote Variante im ITGA2B-Gen (c.1787A>AG, p.I596IT) identifiziert, die aber zu keiner relevanten Aggregations- oder Fibrinogenbindungsstörung führt. Allerdings wurde bei ihr eine gestörte Freisetzung der δ-Granula detektiert. Zudem wurden bei ihr weitere Varianten in Genen nachgewiesen, die im Zusammenhang stehen thrombozytäre Sekretionsstörungen zu verursachen. Hierunter befinden sich die Gene F2RL3, LTBP1 und TGFB1, die vermutlich (primär F2RL3) in Kombination mit der heterozygoten GPIIb-IIIa-Variante zur Blutungsneigung bei der Patientin SPD-2-Index beitragen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Kombination von heterozygoten Varianten in Genen, die für den GPIIb-IIIa-Rezeptor und für Proteine der Signaltransduktion und Sekretion kodieren, zu einer ausgeprägten Thrombozyten-Dysfunktion mit erhöhter Blutungsneigung führen können. Da in der aktuellen Literatur bisher keine vergleichbaren Fälle beschrieben wurden und längst nicht alle Gene bekannt sind, die eine thrombozytäre „Storage Pool“ Erkrankung verursachen, leisten die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis genetischer Ursachen von thrombozytären Granula-Defekten und deren Auswirkungen auf thrombozytäre Signaturen.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5281
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-33d98b89-99a3-4c21-aaea-c39578f17da49
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XI, 121 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen