Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-5206
Authors: He, Yang
Title: Regulation of temozolomide-induced death of glioblastoma cells: dose responses and role of HIPK2
Online publication date: 8-Mar-2022
Language: english
Abstract: Glioblastoma multiforme is the most frequent and aggressive form of high-grade malignant glioma. Due to the dismal prognosis faced by patients suffering from this disease, there is a need for identifying new targets that might improve its therapy. O6-methylguanine (O6-MeG) is the most toxic DNA adduct caused by temozolomide (TMZ). The damage induces DNA double-strand breaks (DSBs) that trigger apoptosis. Since TMZ is used for the treatment of glioblastoma and the dual function of p53 regulates both cell death and cell survival mechanisms, the question arises as to the possible threshold to start apoptosis that is evoked by TMZ. To determine whether there is a threshold for the TMZ-induced DNA damage response and exploring the factors regulating the switch in p53 dependent death or survival in glioblastoma cells, the glioblastoma lines LN229, LN308 and LN229MGMT were exposed to different doses of TMZ. p53 protein expression, phosphorylation levels of p53ser15 and p53ser46 were determined by Western blotting. Apoptosis, senescence and autophagy levels were checked after different doses of TMZ. The results showed that pro-survival (p53ser15) and pro-death (p53ser46) factors are induced by O6-MeG in a dose and time dependent manner. We observed that O6-MeG triggers apoptosis at later time points. A survival shoulder was observed in p53 deficient LN308 cells, but not in p53 proficient LN229 cells after TMZ treatment. LN308 also shows more resistance in senescence and autophagy than LN229 after TMZ treatment, while the two cell lines have the same level of DSBs induced by TMZ. These data suggest that the p53 status may influence the threshold of TMZ-induced damage responses in glioblastoma cells, and the phosphorylation level of p53ser46 can be used as an index of O6-MeG triggered apoptosis. The DNA damage-activated kinase HIPK2 serves as a potent cell death activator through engaging tumor suppressor p53. Whether HIPK2 plays a role in therapy-induced glioblastoma cell death is unknown. In this work, evidence is provided that HIPK2 and its negative regulatory E3 ubiquitin ligase SIAH1 are critical factors controlling TMZ- induced glioblastoma cell death. We show that HIPK2 downregulation (HIPK2kd) significantly reduced the level of TMZ-induced apoptosis. This was not the case in cells expressing the DNA repair enzyme MGMT, which removes TMZ-induced O6-alkylations, suggesting that the primary DNA lesion responsible for triggering HIPK2-mediated death is O6-methylguanine. Following TMZ treatment p53 was phosphorylated at Ser46, and HIPK2kd had an impact exclusively on p53Ser46 while left Ser15 phosphorylation unaffected. TMZ-induced apoptosis in p53 wildtype glioblastoma cells is driven by activation of the death receptor FAS (alias CD95/APO1), which becomes upregulated following TMZ. Accordingly, the expression level of FAS was clearly attenuated upon HIPK2 downregulation, supporting the conclusion that HIPK2 regulates TMZ-induced apoptosis via p53Ser46 driven FAS expression. Using chromatin-immunoprecipitation studies we found that binding of p53 to the FAS promotor is positively regulated by HIPK2. Remarkably, other proapoptotic proteins like PUMA, NOXA, BAX and PTEN were not affected in HIPK2kd. Finally, we show that downregulation of the E3 ubiquitin ligase SIAH1, but not SIAH2, significantly ameliorates TMZ-induced apoptosis, suggesting that the ATM/ATR target SIAH1 plays a key role in TMZ-induced apoptotic death. Since our database analysis revealed that SIAH1 is frequently overexpressed in gliomas, the results bear important implications for TMZ-based malignant brain cancer therapy and suggest the HIPK2-SIAH1 module as a potential target in glioma therapy.
Glioblastoma multiforme ist die häufigste und aggressivste Form eines hochgradigen malignen Glioms. Aufgrund der bedrückenden Prognose von Patienten, die an dieser Krankheit leiden, müssen neue Zielstrukturen („Targets“) identifiziert werden, die die Therapie verbessern könnten. O6-Methylguanin (O6-MeG) ist das toxischste DNA-Addukt, das durch Temozolomid (TMZ) verursacht wird. O6-MeG induziert DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), die Apoptose auslösen. Da TMZ zur Behandlung von Glioblastomen verwendet wird und die Doppelfunktion von p53 sowohl den Zelltod als auch das Überleben der Zellen reguliert, stellt sich die Frage nach der möglichen Schwelle für den Beginn der Apoptose, die von TMZ ausgelöst wird. Um zu bestimmen, ob es einen Schwellenwert für die TMZ-induzierte DNA-Schadensreaktion gibt, und um die Faktoren zu untersuchen, die den Wechsel des p53-abhängigen Todes oder Überlebens in Glioblastomzellen regulieren, wurden die Glioblastom-Linien LN229, LN308 und LN229MGMT verschiedenen TMZ-Dosen ausgesetzt. p53-Proteinexpression, Phosphorylierungsniveaus von p53ser15 und p53ser46 wurden durch Western-Blotting bestimmt. Apoptose, Seneszenz und Autophagie wurden nach verschiedenen TMZ-Dosen überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass die Faktoren Pro-Survival (p53ser15) und Pro-Death (p53ser46) durch O6-MeG dosis- und zeitabhängig induziert werden. Wir haben beobachtet, dass O6-MeG zu späteren Zeitpunkten Apoptose auslöst. Eine Überlebensschulter wurde in p53-defizienten LN308-Zellen beobachtet, nicht aber in p53-wildtypischen LN229-Zellen nach niedrigen TMZ-Dosen. LN308 zeigte auch eine stärkere Resistenz hinsichtlich Seneszenz und Autophagie als LN229 nach TMZ-Behandlung, während die beiden Zelllinien nach TMZ-Behandlung das gleiche Maß an Doppelstrangbrüchen aufweisen. Diese Daten legen nahe, dass der p53-Status die Schwelle für die TMZ-induzierte Schadensreaktion in Glioblastomzellen beeinflussen kann, und der Phosphorylierungsgrad von p53ser46 kann folglich als Index der durch O6-MeG ausgelösten Apoptose verwendet werden. Die durch DNA-Schädigung aktivierte Kinase HIPK2 dient durch Aktivierung des Tumorsuppressors p53 als potenter Zelltodaktivator. Ob HIPK2 eine Rolle bei dem durch TMZ-Therapie induzierten Gliomzelltod spielt, ist nicht bekannt. In dieser Arbeit wird nachgewiesen, dass HIPK2 und seine negativ regulierende E3-Ubiquitin-Ligase SIAH1 kritische Faktoren sind, die den durch TMZ induzierten Glioblastomzelltod steuern. Wir zeigen, dass die Herabregulierung von HIPK2 (HIPK2kd) die Menge an TMZ-induzierter Apoptose signifikant reduziert. Dies war nicht der Fall bei Zellen, die das DNA-Reparaturenzym MGMT exprimieren, wodurch TMZ-induzierte O6-Alkylierungen entfernt werden. Dies legt den Schluss nahe, dass die primäre DNA-Läsion, die für das Auslösen des HIPK2-vermittelten Todes verantwortlich ist, O6-Methylguanin ist. Nach der TMZ-Behandlung wurde p53 am Ser46 phosphoryliert, und HIPK2kd hatte ausschließlich Einfluss auf p53Ser46, während die Ser15-Phosphorylierung nicht beeinflusst wurde. Die durch TMZ induzierte Apoptose in p53-Wildtyp-Glioblastomzellen wird durch die Aktivierung des Todesrezeptors FAS (Alias CD95 / APO1) gesteuert, der nach TMZ hochreguliert wird. Dementsprechend wurde das Expressionsniveau von FAS nach der HIPK2-Herunterregulierung deutlich abgeschwächt, was die Schlussfolgerung stützt, dass HIPK2 die durch TMZ induzierte Apoptose über die p53Ser46-gesteuerte FAS-Expression reguliert. In Chromatin-Immunopräzipitationsstudien wurde festgestellt, dass die Bindung von p53 an den Fas-Promotor durch HIPK2 positiv reguliert wird. Bemerkenswerterweise waren andere proapoptotische Proteine wie PUMA, NOXA, BAX und PTEN in HIPK2kd nicht betroffen. Schließlich zeigen wir, dass die Herunterregulierung der E3-Ubiquitin-Ligase SIAH1, nicht aber SIAH2, die durch TMZ induzierte Apoptose signifikant verbessert, was darauf hindeutet, dass das ATM / ATR-Ziel, SIAH1, eine Schlüsselrolle beim durch TMZ induzierten apoptotischen Tod spielt. Da eine Datenbankanalyse ergab, dass SIAH1 häufig in Gliomen überexprimiert wird, haben unsere Ergebnisse wichtige Implikationen für die TMZ-basierte Krebs-Chemotherapie, indem sie das HIPK2-SIAH1-Modul als potenzielles "Target" in der Gliomtherapie vorschlagen.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-5206
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-eb800087-9f0d-4ec5-9a80-d371cf04afe93
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: IX, 115 Seiten, Illustrationen, Diagramme
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