Authors:	Prochnow, Hans-Peter
Title:	Charakterisierung und funktionelle Analyse verschiedener Isoformen von Clusterin (Apolipoprotein J)
Online publication date:	7-Oct-2020
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Clusterin (CLU), auch bekannt unter dem Namen Apolipoprotein J (ApoJ), wird von Zellen als hetreodimeres Glykoprotein exprimiert und in den extrazellulären Raum sezerniert. Es wird daher auch als sezerniertes CLU (sCLU) bezeichnet. Neben sCLU sind auch nicht-sezernierte Isoformen von CLU bekannt, die in der vorliegenden Arbeit erforscht wurden. Ziel dabei war es, die Expression, die Biogenese, sowie die Funktion dieser Proteine zu ergründen. Nicht-sezernierte CLU-Formen werden ausschließlich von Zellen exprimiert, die zuvor einer Stresssituation ausgesetzt wurden. Dies konnte insbesondere durch Kultur verschiedener Zelllinien bei erhöhter Temperatur oder durch Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG 132 demonstriert werden, worauf neben sCLU auch 50â kDa bzw. 45â kDa große, nicht-sezernierte CLU-Proteine in geringen Mengen exprimiert wurden. Bezüglich der Biogenese dieser Proteine wurden mehrere Hypothesen bzw. Mechanismen diskutiert und in dieser Arbeit untersucht: alternative Translationsstartpunkte auf verschiedenen mRNAs, alternatives Splicing einzelner mRNAs sowie Retrotranslokation oder Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen. Um die Hypothesen eruieren zu können, musste zuerst eine Expressionsanalyse der bekannten CLU-mRNAs durchgeführt werden. Über 5â -RACE, semi-quantitative und quantitative PCRs wurde die Expression von vier CLU-mRNAs sowie deren Induktion auf Zellstress hin festgestellt. Variante 1 (BP211675) ist die dominante CLU-mRNA und macht über 99,5â % an CLU-mRNA in unbehandelten sowie in gestressten Zellen aus. Des Weiteren sind geringste Mengen der mRNA-Varianten 2 und 3 (NR_038335.1 und NR_045494.1) detektiert worden, deren Sequenzen sich lediglich in ihrem alternativen Exon 1 von Variante 1 unterscheiden. Schließlich konnte die Expression von Variante 1 [Î ex2] festgestellt werden, welcher durch alternatives Splicing, i.e. Exon-skipping, das Exon 2 mit der ER-Signalsequenz-codierenden Region (SSCR) fehlt. HEK 293-Zellen, die transient mit je einer der rekombinanten CLU-mRNAs in Form rekombinanter cDNA transfiziert wurden, exprimierten neben großen Mengen sCLU auch geringe Mengen an den nicht-sezernierten CLU-Isoformen. Die anschließend durchgeführten in vitro Mutagenesen belegen, dass alle Isoformen ausgehend von distinkten Translationsstartpunkten aus synthetisiert werden. CLU1-449 (50â kDa) wird als prä-Proprotein von sCLU ausgehend von einem Startcodon auf Exon 2 unmittelbar vor der SSCR translatiert. Unter Zellstress-Bedingungen kann es zu einer Mistranslokation während der co-translationalen Translokation kommen, sodass Teile von CLU1-449 im Cytosol akkumulieren. CLU21-449 (50â kDa) wird ausgehend von einem CUG-Startcodon downstream der SSCR über interne Translationsinitiation gebildet. Analoges gilt für CLU34-449 (45â kDa), welches von einem AUG-Startcodon auf Exon 3 translatiert wird. CLU34-449 ist außerdem die einzige CLU-Form die von Variante 1 [Î ex2] codiert wird. Somit konnten drei der in der Literatur postulierten Mechanismen zur Ent-stehung nicht-sezernierter CLU-Isoformen in gestressten Zellen verifiziert werden. Die Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen, welche entscheidend zum Auftreten der nicht-sezernierten CLU-Formen beiträgt, die Alternative Translationsinitiation an distinkten Startcodons sowie das alternative Splicing von CLU-mRNA-Variante 1. Weiterführende Experimente bestätigten, dass alle nicht-sezernierten CLU-Isoformen im Cytosol der Zellen lokalisiert sind und keine Glykosylierungen tragen. Somit konnte ein weiterer, in der Literatur kontrovers diskutierter Punkt bezüglich dieser Proteine geklärt werden. Abschließend wurde die physiologische Funktion der einzelnen CLU-Isoformen analysiert. Dabei zeigte sich, dass ausschließlich sCLU eine Chaperonaktivität zukommt, die es ermöglicht, durch Hitze denaturierte Zielproteine in Lösung zu halten. Diese Funktion konnte nicht für die cytosolischen Iso¬formen bestätigt werden. Weiterhin konnte keine Auswirkung einzelner CLU-Formen auf die intrinsische Apoptose oder auf den NF κB-vermittelten Signaltransduktionsweg festgestellt werden, obgleich entsprechende Einflüsse von anderen Arbeitsgruppen postuliert wurden. Die hier gemachten Beobachtungen werfen daher die Frage auf, ob den nicht-sezernierten, cytosolischen CLU-Isoformen überhaupt eine physiologische Funktion zukommt und stellen aktuelle Hypothesen bezüglich der Rolle von CLU bei pathophysiologischen Prozessen infrage. Clusterin (CLU), also known as Apolipoprotein J, is secreted from cells into the extracellular space as a heterodimeric glycoprotein. Therefore, it is also termed secretory Clusterin (sCLU). Besides sCLU the existence of non-secreted isoforms of CLU has been reported. Investigation of expression, biogenesis and functions of these CLU-forms was the target of the present thesis. Non-secreted CLU-forms are exclusively expressed in stressed cells. Besides sCLU, cells cultivated under elevated temperature or in presence of the proteasome inhibitor MG-132 express minor amounts of a 50 kDa and a 45 kDa CLU-form, which are not secreted. Several mechanisms as to their biogenesis are currently discussed in literature and were examined in this work: 1) alternative translational start sites on distinct mRNAs; 2) alternative splicing of CLU-mRNA; 3) retrotranslocation or 4) mistranslocation of sCLU-precursor proteins. To evaluate these hypotheses, an analysis of the CLU-mRNAs was necessary. Hence, the expression of four different CLU-mRNAs was verified via 5â -RACE, semi-quantitative and quantitative PCR methods. Further, their induction was demonstrated under cellular stress. Variant 1 (BP211675) represents the dominant CLU-mRNA, which contributes more than 99.5 % to the copy number of total CLU-mRNA. Variants 2 and 3 (NR_03835.1 and NR_045494.1) differ in their exon 1 sequences from variant 1 and were only detectable in minor amounts. Moreover the expression of variant 1 [Î ex2], which derives from alternative splicing (exon-skipping) of variant 1 and omits exon 2 with the ER-signal sequence coding region (SSCR), was detectable. HEK-293 cells transiently overexpressing recombinant CLU-mRNA variants 1, 2 and 3 from corresponding cDNA-constructs all synthesize recombinant sCLU, respectively. However, expression of the non-secreted CLU-forms was also observed in these cells. Further experiments utilizing in vitro mutagenesis revealed, that translation of the single CLU-forms originates from distinct start sites on the CLU-mRNA. CLU1-449 (50 kDa) is the pre-proprotein of sCLU and is thus translated from a start codon immediately upstream of the SSCR. In cell-stress situations a mistranslocation of this CLU-form, which is usually co-translationally translocated to the endoplasmatic reticulum where it turns into sCLU, can occur. Hence, minor amounts of CLU1-449 accumulate in the cytosol. Non-secreted CLU21-449 (50 kDa) is translated from a CUG-startcodon located immediately downstream of the SSCR. This is initiated by internal translation initiation on exon 2 of the CLU-mRNA. The same holds true for CLU34-449 (45 kDa), a non-secreted CLU-form which is translated from an AUG-startcodon on exon 3. CLU34-449 is also the only CLU-form encoded by variant 1 [Î ex2]. Thus, three of the proposed hypotheses regarding the biogenesis of non-secreted CLU-forms have been verified: 1) mistranslocation of sCLU-pre-proprotein, which contributes for the most part to the expression of non-secreted CLU-forms; 2) alternative translation initiation at distinct start codons and 3) alternative splicing of CLU-mRNA variant 1. Additional experiments have provided evidence, that all non-secreted CLU-forms reside in the cytosol of cells and do not carry any polysaccharide moieties. Finally, functional analyses of the distinct CLU-forms were carried out. It was shown, that sCLU exhibits a chaperone activity by solubilizing misfolded proteins. This property, however, is not shared by the cytosolic CLU-forms. Further, the distinct CLU-forms neither have an impact on the intrinsic apoptosis-pathway nor do they influence the NF-κB-mediated signaling pathway. Hence, the results presented in the present work challenge some of the current hypotheses regarding the in vivo role of CLU and raise the question, whether cytosolic CLU-forms do have a physiological function after all.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Department:	FB 10 Biologie
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5195
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-36539
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	134 S.
Publisher:	Johannes Gutenberg-Universität
Publisher place:	Mainz
Issue date:	2014
Appears in collections:	JGU-Publikationen