Authors:	Nick, Thomas
Title:	Stability of split-aptamers
Online publication date:	7-Oct-2020
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	Oligonucleotide aptamers are widely used in fundamental research, diagnostics and technical applications, because of their property to bind analytes with high affinity and specificity. Analyte-binding can cause a change of the flanking nucleotides and thus of the aptamer structure. By combining two binding-sites with a so called communication module, the structural change of one binding-site can be transduced to the other binding-site. However, for such a construct, at least one aptamer has to be split into two strands. The aim is, to develop split-aptamers, which regained their analyte-binding property upon hybridization of the two strands. A significant stabilization of the aptamer upon analyte-binding is desired, which can be determined by monitoring the dissociation of the oligonucleotide-strands. A force-induced dissociation of a split-aptamer, which binds streptomycin, was investigated by means of single-molecule force spectroscopy measurements. Rate dependent measurements revealed a decrease in the off-rate for the aptamer-streptomycin complex (koff-COMPLEX = 0.22 ± 0.16 s-1) compared to the aptamer, having an empty binding pocket (koff-APTAMER = 0.49 ± 0.11 s-1). In the context of the Bell-Evans potential, a decrease in the Gibbs free energy of ≈ 3.4 kJ mol-1 emerged. The results led to the conclusion that the hydrogen-bonds between both RNA strands mainly contribute to the stability of the aptamer system studied. In a different approach, the dissociation of oligonucleotides was investigated by means of temperature dependent UV/Vis-absorbance measurements. Here, an increase in the melting temperature upon analyte-binding indicated the functionality of the binding-site. A suitable splitting position was identified for the neomycin-aptamer between the nucleotides A14 and G15. The split neomycin-aptamer showed the same shift in the melting temperature as the original neomycin-aptamer. Thus, the functionality of the binding-site was verified. The binding-sites were connected with a communication module of three nucleotides length. The truncation of the communication module to a length of one nucleotide revealed a decreased functionality of the Hg2 -binding DNA. The simultaneous presence of neomycin molecules compensated the destabilization and the affinity of Hg2 -ions to the binding-site was restored. Thus, an oligonucleotide with a positive allostery was developed, which exhibits a ≈ 13 °C larger melting temperature upon binding of both analytes, compared to the unbound aptamer. This system might be the basis for molecular switches. Oligonukleotid-Aptamere sind weit verbreitet in der Grundlagenforschung, in der Diagnostik und in technischen Anwendungen, weil sie Analyte mit hoher Affinität und Spezifität binden können. Die Analytbindung kann eine Strukturänderung des Aptamers und der flankierenden Oligonukleotide verursachen. Beim Verbinden von zwei Bindungs-Stellen mit einem Kommunikationsmodul, kann die strukturelle Änderung von einer Bindungs-Stelle auf die andere Bindungs-Stelle übertragen werden. Für die Kombination eines Aptamers mit anderen Nukleotiden, ist das Aufspalten des Aptamers in zwei separate Oligonukleotid-Stränge von größter Wichtigkeit. Das Ziel ist es, geteilte Aptamere zu entwickeln, die nach Hybridisierung der Oligonukleotid-Stränge wieder die Bindungs-Stelle ausformen und den Analyten binden. Des Weiteren ist eine signifikante Stabilisierung des Aptamers bei Analyt-Bindung erwünscht, welche anhand der Dissoziation der Oligonukleotid-Stränge bestimmt werden kann. Eine Kraft-induzierte Dissoziation des gespaltenen-Aptamers, welches Streptomycin bindet, wurde mittels einzelmolekülkraftspektroskopischer Messungen durchgeführt. Raten-abhängige Messungen zeigten eine Verringerung der off-Rate für den Aptamer-Streptomycin-Komplex (koff-COMPLEX = 0.22 ± 0.16 s-1), im Vergleich zum Aptamer mit leerer Bindungstasche (koff-APTAMER = 0.49 ± 0.11 s-1). Im Kontext des Bell-Evans-Potentials, ergibt sich eine Verringerung der Gibbs freien Energie von ≈ 3.4 kJ mol-1. Das Resultat führt zu der Schlussfolgerung, dass hauptsächlich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Oligonukleotid-Strängen zur Stabilisierung des Aptamers beitragen. In einem anderen Ansatz, wurde die Dissoziation der Oligonukleotid-Stränge mittels temperatur-abhängiger UV/Vis-Spektroskopie untersucht. Eine Erhöhung der Schmelztemperatur des Aptamers bei Analyt-Bindung, war ein Zeichen für eine funktionelle Bindungs-Stelle. Eine geeignete Spalt-Position für das Neomycin-Aptamer, wurde zwischen den Nukleotiden A14 und G15 identifiziert und anhand einer Erhöhung der Schmelztemperatur bestätigt. Anschließend wurden die Bindungs-Stellen mittels eines Kommunikations-Moduls verbunden, das aus drei Nukleotiden bestand. Die Verkürzung des Kommunikations-Moduls auf ein Nukleotid führte zu einer verringerten Funktionalität der Hg2 -bindenden DNA. Die gleichzeitige Präsenz von Neomycin Molekülen, kompensierte die Destabilisierung und stellte die Funktionalität der Hg2 -bindenden DNA wieder her. Damit wurde ein Oligonukleotid mit positiver Allosterie entwickelt, das eine ≈ 13 °C Schmelztemperatur bei gleichzeitiger Anwesenheit von Hg2 -Ionen und Neomycin Molekülen aufweist. Dieses System könnte eine Basis für neue molekulare Schalter darstellen.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5192
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000009178
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xvi, 116 Seiten
Publisher:	Johannes Gutenberg-Universität
Publisher place:	Mainz
Issue date:	2017
Appears in collections:	JGU-Publikationen