Authors:	Orlandini von Niessen, Alexandra
Title:	Optimization of RNA cancer vaccines using 3' UTR sequences selected for stabilization of RNA
Online publication date:	7-Oct-2020
Language:	english
Abstract:	In the last decades, in vitro-transcribed (IVT-)messenger (m)RNAs encoding tumor-specific antigens have emerged as a powerful new tool to deliver genetic information into human immature dendritic cells (hiDCs) to induce a specific antitumor T cell response for therapeutic cancer vaccination. However, the short half-life of mRNA is still a major challenge. This makes the pharmacologically effective dosing of IVT-mRNA difficult, resulting in a time-restricted protein expression and, thus, a limited immune response. The stability of mRNAs is mainly regulated by the 3' untranslated region (3' UTR) as exemplified by the well-characterized ß-globin 3' UTR that is responsible for the high stability of globin mRNA in erythrocytes. Stability is controlled by binding of regulatory factors to respective sequence elements in the 3' UTR. While the ß-globin 3' UTR also stabilizes synthetic mRNAs to some degree in other cell types, such as hiDCs, the expression of the specific regulatory factors for RNA-stability is cell-type specific. Therefore, the identification of hiDC-specific stabilizing RNA-sequence elements could further improve intracellular pharmacokinetics of mRNA cancer therapeutics. In this work, a novel in vitro selection process within hiDCs was developed to find naturally occurring RNA sequence elements, which stabilize the mRNA when used as 3' UTR in preclinical and clinical studies. Instead of using a chemically synthesized library for the selection process, a self-made RNA-library was built with hiDC-specific RNA sequences cloned as 3' UTR downstream of a suitable reporter gene. Additionally, hiDCs were used as a selective environment. This ensured the selection of cell-type specific RNA sequences as the cell's inner regulatory factors [RNA-binding proteins (RBPs) and microRNAs (miRNAs)] and degradation machineries would determine the survival of the transfected RNAs. The stringency of the selection was increased with each selection round by extending the time frame, in which the transfected RNA-pool was left in the cells before purification, amplification and preparation for the next selection round. The selected 3' UTR-sequences were analyzed and characterized afterwards. New single RNA-elements were identified and analyzed individually as single 3' UTR or in combination as double 3' UTR regarding their stabilizing effect on mRNA. Differences in the stabilizing effect of the analyzed 3' UTRs were rationalized in silico regarding binding of RBPs and miRNAs. Results revealed less binding of miRNAs, particularly in two combinations, which also proved to be superior compared to 2hBg, the in-house gold standard consisting of two copies of the human ß-globin 3' UTR. These combinations enhanced not only stability, but also translational efficiency of the synthetic mRNA in hiDCs yielding more protein over time. With these new potent 3' UTRs, RNA cancer immunotherapy can be further improved regarding antitumor efficacy due to a prolonged lifespan of the synthetic mRNA and an increased protein amount, thus, ultimately providing better patient care. Moreover, with this generally applicable method, cell-type specific 3' UTRs can be selected for other therapeutic fields like stem cell research or protein-replacement therapies to ensure optimal pharmacokinetics of synthetic mRNAs. In den vergangenen Jahrzehnten entwickelten sich in vitro transkribierte (IVT)-Boten-RNAs (englisch messenger RNA, mRNA) zu einem neuen, wirkungsvollen Mittel tumorspezifische Antigene in humane immature dendritische Zellen (hiDCs) zu übertragen, um eine effektive und zielgerichtete Immunantwort gegen Krebs auszulösen. Jedoch bleibt hierbei die kurze Halbwertszeit der RNA weiterhin eine große Herausforderung. Die daraus resultierende zeitlich begrenzte Expression des kodierten Tumorantigens und die damit einhergehende limitierte Immunantwort, erschwert dabei eine effektive pharmakologische Dosierung von mRNA-basierten Tumorvakzinen. Die Stabilität einer mRNA wird hauptsächlich von dem 3' untranslatierten Bereich (englisch untranslated region, 3' UTR) beeinflusst. Dieses wird z.B. mit dem sehr gut charakterisierten ß-Globin 3' UTR veranschaulicht, welches den Globin-mRNAs in den Erythrozyten eine hohe Stabilität verleiht. Die Stabilität wird dabei durch die Bindung von regulatorischen Faktoren an spezifischen Elementen in dem 3' UTR geregelt. Während das ß-Globin 3' UTR auch synthetische mRNA in anderen Zelltypen wie z.B. hiDCs stabilisiert, ist die Expression der RNA-stabilisierenden Faktoren zellspezifisch. Folglich könnte die Identifizierung von hiDC-spezifischen stabilisierenden Sequenzen die intrazelluläre Pharmakokinetik von mRNA-Krebstherapeutika deutlich verbessern. In dieser Arbeit wurde ein neuartiger Selektionsprozess innerhalb von hiDCs entwickelt und durchgeführt, um eben solche natürlich vorkommende RNA-Sequenzen zu finden, die - als 3' UTR angewandt - die für (prä)klinische Studien eingesetzte mRNA mehr stabilisieren als bisher. Anstatt eine chemisch synthetisierte Bibliothek für den Selektionsprozess zu verwenden, wurde die RNA-Bibliothek mit hiDC-spezifischen RNA-Sequenzen selbst hergestellt. Dabei wurden diese Sequenzen als 3' UTR in einen geeigneten Vektor kloniert. Der eigentliche Selektionsprozess fand zudem in hiDCs statt. Das sollte die Selektion zell-spezifischer RNA-Sequenzen sicherstellen, da die inneren regulatorischen Faktoren [RNA-binde Proteine (RBPs) und microRNAs (miRNAs)] und Degradationsproteine der Zelle das Überleben der transfizierten mRNA bestimmen würden. Die Stringenz der Selektion wurde mit jeder Selektionsrunde verstärkt, in dem die Zeitspanne zwischen der Transfektion des RNA-Pools in die Zellen und dem Aufreinigen, Vervielfältigen und Vorbereiten für die nächste Selektionsrunde verlängert wurde. Nach dem Selektionsprozess wurden die erhaltenen 3' UTR-Sequenzen untersucht und charakterisiert. Es konnten neue Sequenzen identifiziert werden, welche einzeln als einfaches 3' UTR oder in Kombination als doppeltes 3' UTR weiter untersucht wurden bezüglich ihrer stabilisierenden Eigenschaften auf die mRNA. Die ermittelten stabilisierenden Effekte der 3' UTRs wurden n aher mittels bioinformatischer Analysen bezüglich der Bindung von RBPs und/ oder miRNAs rationalisiert. Die Ergebnisse zeigten eine geringere Anzahl an bindenden miRNAs, insbesondere bei den zwei 3' UTR-Kombinationen, die dem 2hBg-3' UTR überlegen waren. Diese zwei Kombinationen verbesserten nicht nur die Stabilität, sondern auch die Translationseffizienz der synthetischen mRNA in den hiDCs, was in Summe zu einer erhöhten Gesamtproteinmenge führte. Mit dieser neuen, wirkungsvolleren 3' UTR, sollte die RNA-Krebsimmuntherapie aufgrund einer verlängerten mRNA-Lebenszeit bzw. einer erhöhten -Proteinmenge, und damit einhergehend, letzten Endes das Patientenwohl, deutlich verbessert werden können. Darüber hinaus können mit der entwickelten allgemein anwendbaren Methode zellspezifische 3' UTRs für andere therapeutische Zwecke wie z.B. für die Stammzelltherapie oder Protein-Ersatz-Therapie selektiert werden, um auch für diese Anwendungen die optimale Pharmakokinetik der eingesetzten synthetischen mRNA sicherzustellen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Department:	FB 04 Medizin
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5189
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008115
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	X, 108, VIII Seiten
Publisher:	Johannes Gutenberg-Universität
Publisher place:	Mainz
Issue date:	2016
Appears in collections:	JGU-Publikationen