Authors:	Fend-Guella, Desiree Lucia
Title:	DNA-Methylierungsprofil von humanen spermatogonialen Stammzellen auf Einzelzell- und Einzelallel-Ebene und Der Einfluss von frühkindlichem Stress auf die Krankheit der Tuberösen Sklerose im Tsc2+/--Mausmodell
Online publication date:	9-Oct-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Humane spermatogoniale Stammzellen (hSSCs) stellen eine Subpopulation von Spermatogonien (SPG) dar, welche die Kapazität zur Selbsterneuerung haben und eine lebenslange Spermatogenese gewährleisten. Im therapeutischen Rahmen einer Infertilitätsbehandlung können hSSCs zur Wiederaufnahme der Spermatogenese nach einer gonadotoxischen Exposition oder von männlichen Erwachsenen mit Keimzellen im Meiose-Arrest eingesetzt werden. In diesem Kontext ist die in vitro-Vermehrung von hSSCs erforderlich, jedoch kann dies zur Bildung von Teratomen führen und die epigenetische Signatur verändern. Aus diesem Grund ist die molekulargenetische Charakterisierung von hSSCs vor einer in vitro-Kultur essentiell und aktuell Gegenstand der Forschung. Nicht-proliferierende und nicht-differenzierende SPG exprimieren das Protein „Fibroblast Growth Factor Receptor 3“ (FGFR3) auf der Zellmembranoberfläche (FGFR3+-SPG). Hingegen enthalten SPG, welche in den Prozess der Zelldifferenzierung geschleust werden, kein FGFR3 (FGFR3--SPG). In diesem Teilprojekt wurde die DNA-Methylierung in den regulatorischen Regionen von paternal (H19, MEG3) und maternal (KCNQ1OT1, PEG3, SNRPN) geprägten Genen, von SPG-Markergenen (FGFR3, GFRA1, PLZF, L1TD1) und von Pluripotenzgenen (POU5F1/OCT4, NANOG) in unkultivierten FGFR3+- und FGFR3--SPG untersucht und mit der DNA-Methylierung von Spermien und somatischen Zellen verglichen. Unter Anwendung der Limiting Dilution (LD)-Methode und Bisulfit-Pyrosequenzierung wurde das Methylierungsmuster von einzelnen Zellen und einzelnen Allelen erfasst. Die untersuchten Kontrollregionen der paternal geprägten Gene und der Pluripotenzgene waren in FGFR3+-SPG, FGFR3--SPG und Spermien methyliert. Im Gegensatz dazu waren die regulatorischen Regionen der maternal geprägten Gene und der SPG-Markergene in den Keimzellen unmethyliert. Bei näherer Betrachtung der Methylierung der elterlich geprägten Gene fiel eine Fraktion einzelner Cytosin-Phosphat-Guanin (CpG)-Dinukleotide und Allele auf, die eine gegenteilige (inverse) Methylierung aufwiesen. Der Anteil dieser Fraktion war am größten in FGFR3+-SPG, geringer oder abwesend in FGFR3--SPG und abwesend in Spermien. In der männlichen Keimbahn wird die DNA-Methylierung fast vollständig aufgehoben und geschlechts-spezifisch neu gesetzt. Dabei werden die elterlich geprägten Gene und sogar die Allele eines geprägten Gens asynchron remethyliert. Das detektierte Muster invers methylierter CpGs und Allele deutete daher auf gen- und allelspezifische Methylierungsdynamiken hin, die während der Spermatogenese erfolgen. Daraus lässt sich das Fazit ziehen, dass die in der Keimbahn einsetzende Remethylierung in SPG noch nicht vollständig abgeschlossen ist, sondern erst in ausgereiften Spermien. Dieses Ergebnis stimmt mit den Erkenntnissen anderer Studien zur DNA-Methylierung von humanen und murinen Keimzellen in verschiedenen Differenzierungsstadien überein. Im biologischen Kontext sind während der Spermatogenese genetische Prozesse erforderlich, welche der männlichen Keimzelle ihre Identität verleihen und sie dadurch in ein entsprechendes Stadium versetzen bzw. den Übergang in das nächste Stadium induzieren. Die untersuchte Kontrollregion von FGFR3 war in beiden SPG-Gruppen und den Spermien unmethyliert. Jedoch wurde FGFR3 nur in der Zellmembran von in nicht-proliferierenden und nicht-differenzierenden SPG detektiert und entsprechend als hSSC-Marker zur Zellselektion für diese Arbeit verwendet. Da auch andere Studien FGFR3 als hSSC-Marker bestätigt haben, trägt entweder eine andere regulatorische Region oder ein anderer epigenetischer oder zellspezifischer Mechanismus dazu bei, dass FGFR3 nur an der Zelloberfläche von hSSCs auftritt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von frühkindlichem Stress (early-life stress, ELS) auf die Krankheit der Tuberösen Sklerose (Tuberous sclerosis complex, TSC) in einem Tsc2+/--Mausmodell untersucht. Es wurde ein in der Wissenschaft häufig verwendetes ELS-Paradigma adaptiert, bei dem Mütter zusammen mit ihrem Wurf vom postnatalen Tag 2 bis 9 in einem spärlich ausgestatteten Versuchskäfig mit reduziertem Nistmaterial verbrachten. Dieses ELS-Paradigma wurde mit C57BL/6J-Mäusen etabliert. Aufgrund einer signifikant veränderten Mutter-Kind-Interaktion während der ELS-Phase sowie zudem signifikant erhöhten Corticosteron-Werten und einer signifikanten Gewichtsreduktion bei den ELS-Nachkommen wurde das ELS-Paradigma als validiert betrachtet. Die Nachkommen der Etablierungsphase wurden ferner im Alter von 8 bis 16 Wochen hinsichtlich ihrer Kurz- und Langzeiterinnerung analysiert. Es gab keine Hinweise darauf, dass die kognitive Kapazität durch ELS beeinträchtigt war. Jedoch fielen ältere ELS-Nachkommen durch eine signifikant verminderte Erkundungszeit auf. Zur Untersuchung des Einflusses von ELS auf TSC wurden C57BL/6J-Mütter mit Tsc2+/--Männchen verpaart. Abhängig von ihrer Stresserfahrung (kein Stress / ELS) und ihrem Genotypen (Tsc2+/- / Wildtyp) wurden vier Gruppen analysiert: (1) wildtypische ungestresste Kontrollmäuse (KONT-wt), (2) ungestresste Tsc2+/--Tiere (KONT-het), (3) wildtypische ELS-Tiere (ELS-wt) und (4) ELS-erfahrene Tsc2+/--Mäuse (ELS-het). Die Tiere wurden im Alter von 2, 4 und 6 Monaten hinsichtlich ihres Angst- und Sozialverhaltens untersucht. Zusätzlich wurden die Mäuse im Alter von 4 und 6 Monaten auf ihre kognitiven Fähigkeiten überprüft. Die Mäuse wurden wiederholt getestet (Retest), um einen fortschreitenden Einfluss von entweder ELS oder der Tsc2-Mutation festzustellen.Zwei Monate alte ELS-wt-Mäuse waren weniger ängstlich und sozial interaktiver, was auf einen anxiolytischen Effekt durch ELS hindeuten könnte. Im Alter von 4 Monaten fielen ELS-het-Tiere durch verminderte Leistung des Arbeitsgedächtnisses auf, während ihr Langzeitgedächtnis unbeeinträchtigt war. Zudem zeigte diese Gruppe erhöhtes Interesse bzw. erhöhte Motivation während des Versuchs, was bis zum Alter von 6 Monaten fortbestand. Diese Beobachtung könnte auf einen protektiven Effekt durch ELS bei bestehender Tsc2-Mutation deuten. Die ersten Hinweise auf eine negative Auswirkung von ELS zeigte die ELS-wt-Gruppe im Alter von 6 Monaten durch eine verminderte Langzeiterinnerung. Insgesamt waren die hier nachgewiesenen Unterschiede subtil und nicht konsistent. Da in der Literatur deutliche Effekte für jeden der beiden untersuchten Faktoren „ELS“ bzw. „Tsc2-Mutation“ beschrieben wurden, wurde überprüft, ob wiederholte Verhaltenstests einen zusätzlichen Einfluss auf die hier untersuchten Tiere hatten. Dabei zeigte sich, dass sich wildtypische Test-erfahrene Mäuse signifikant anders als Test-naive Mäuse verhielten. Somit wurde ein Retest-Effekt bestätigt. In diesem Kontext könnten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hindeuten, dass wiederholtes Testen die negativen Folgen einer frühkindlichen Stresserfahrung bzw. die Entwicklung einer TSC-Symptomatik – zumindest auf Verhaltensebene – hinauszögern könnte.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 570 Biowissenschaften 570 Life sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5182
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-f1c6529e-af8d-410d-8954-06cb7a2959bf4
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIII, 164 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen