Authors:	Ziegler, Kira
Title:	Inflammatory processes and TLR4 signaling influenced by nitrated proteins and related substances
Online publication date:	17-Mar-2021
Year of first publication:	2021
Language:	english
Abstract:	Akute und chronische Entzündungen sind Bestandteil und Prozess vieler Krankheiten. Hierbei spielt der Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) eine zentrale Rolle, da er schadens- und pathogen-assoziierte Muster wie bakterielle Lipopolysaccharide und verschiedene Proteine erkennt. Beispielsweise kann der TLR4 durch Amylase-Trypsin-Inhibitoren (ATI) stimuliert werden, welche als Bestandteil von glutenhaltigem Getreide (zum Beispiel Weizen) über die Nahrung aufgenommen werden. Die durch ATI vermittelte TLR4-Stimulierung kann myeloide Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen im Darm aktivieren und intra- und extraintestinale Entzündungen auslösen. Im Zuge der Entzündungsreaktionen werden entzündliche Zytokine ausgeschüttet und reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies gebildet. Zu diesen reaktiven Spezies zählt Peroxynitrit, welches antimikrobiell wirkt und zudem Proteine nitrieren kann. Proteine können auch durch umweltbedingte reaktive Spezies wie Stickstoffoxide und Ozon nitriert werden. In beiden Fällen hat die Nitrierung Auswirkungen auf die chemische Struktur des Proteins, wodurch seine immunologische und allergene Reaktivität beeinflusst werden kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit habe ich die immunstimulierende Wirkung von nativen und nitrierten ATI sowie von weiteren Proteinen, welche den TLR4 stimulieren können, untersucht. Zwecks simultaner Detektion von TLR4-Stimulierung und von toxischen Effekten wurde eine stabile, monoklonale Zelllinie entwickelt und etabliert. Zusätzlich wurde eine Methode zur Kultivierung von primären humanen Makrophagen optimiert, welche maßgeschneidert für die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie ist. Mit Hilfe dieser Methode konnte eine spenderabhängige TLR4-Cluster-Bildung im Nanobereich sichtbar gemacht werden, was mittels konventioneller Methoden nicht möglich gewesen wäre. Die Hauptergebnisse dieser Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: Es wurde deutlich, dass nitrierte ATI eine erhöhte Immunreaktion bei primären humanen myeloiden Immunzellen hervorrufen. Dies zeigte sich in einer erhöhten Translokation von NF-κB in die Zellkerne, einer verstärkten sekundären T-Zell-Proliferation sowie einer gesteigerten Produktion von entzündlichen Zytokinen. Zusätzlich konnte für weitere TLR4-stimulierende Proteine (ATI, α-Synuclein, Hitzeschockprotein 60, High-Mobility-Group-Protein B1, Pollenallergen Phl p 5) nach der Behandlung mit Peroxyntirit eine erhöhte Entzündungsreaktion festgestellt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Protein-Nitrierung und die damit verbundenen Mechanismen, wie zum Beispiel die Oligomerisierung, nicht nur ein Resultat entzündlicher Reaktionen sind. Vielmehr werden diese entzündlichen Reaktionen in einem selbstverstärkenden Prozess über Toll-like-Rezeptoren ausgelöst oder aufrechterhalten. Über meine oben genannten Forschungen und die damit verbundenen Resultate hinausgehend wurden ethanolische Pflanzenextrakte sowie Cyanobakterien hinsichtlich ihrer entzündungshemmenden und -auslösenden Wirkung untersucht. Dabei konnte bei zwei Pflanzenextrakten eine durch die Toll-like-Rezeptoren 2 und 4 vermittelte antientzündliche Wirkung identifiziert werden. Weiterhin wurden zwei Cyanobakterien-Spezies gefunden, die eine TLR4-vermittelte entzündliche Wirkung aufweisen. Zusammenfassend bietet diese Dissertation neue Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen entzündlicher Prozesse sowie über deren Potenzierung durch intrinsische und umweltbedingte Faktoren, insbesondere durch die Protein-Nitrierung. Sie zeigt außerdem mögliche Perspektiven der entzündungshemmenden medizinischen Behandlung auf. Inflammatory processes are involved in numerous acute and chronic diseases. In this context, the Toll-like receptor 4 (TLR4) plays a central role by detecting pathogen- and damage-associated molecular patterns such as lipopolysaccharides and various proteins. For example, the TLR4 can be stimulated by nutritional amylase trypsin inhibitors (ATI), nongluten proteins that are associated with gluten containing grains like wheat. In the gut, ATI can activate immune cells, especially myeloid cells (macrophages and dendritic cells), via TLR4, thereby initiating or enhancing intra- and extra-intestinal inflammation. Upon stimulation of the TLR4 and in the course of inflammation, pro-inflammatory cytokines are secreted and reactive oxygen- and nitrogen species are generated. Among these reactive species is peroxynitrite, which is an anti-microbial and protein-nitrating agent. Proteins can also be nitrated by reactive species in the environment such as nitrogen oxides and ozone in polluted air. Either way, nitration leads to modifications in the chemical structure of proteins and can result in altered immune responses and allergic reactions. This dissertation investigates the immunostimulatory effects of native and nitrated ATI and other TLR4 stimulating proteins. For this purpose, I developed and established a new stable monoclonal TLR4 reporter cell line to measure simultaneously TLR4 stimulation and toxic effects. Moreover, I optimized a method for the isolation and culturing of human primary macrophages tailored to the requirements of single molecule microscopy. This method revealed donor-dependent differences in TLR4 surface clustering on the nanoscale induced by nitrated ATI, which were not accessible to detection by conventional methods. The key scientific findings of this dissertation can be summarized as follows: Nitrated ATI were found to enhance the immune response of primary human myeloid immune cells, resulting in increased nuclear translocation of NF-κB, secondary T cell proliferation, and pro-inflammatory cytokine secretion. Moreover, chemical modifications by peroxynitrite were found to amplify the inflammatory potential of several TLR4-stimulating proteins (ATI, α-synuclein, heat shock protein 60, high mobility group protein B1, grass pollen allergen Phl p 5). These findings suggest that protein nitration and related chemical modifications, such as oligomerization, may not only be a result of inflammation, but may also trigger or maintain inflammatory processes in a self-amplifying feedback cycle involving Toll-like receptors. In addition to the above studies and results, the pro- and anti-inflammatory effects of herbal extracts and Cyanobacteria were investigated: Two herbal extracts with previously unknown anti-inflammatory toll like receptor 2 and 4 mediated activity were identified, and two species of Cyanobacteria were found to induce pro-inflammatory TLR4 signaling. Overall, this dissertation provides new insights into the molecular mechanisms of inflammation, their potentiation by intrinsic and environmental factors, especially the process of protein nitration, and potential perspectives of medical anti-inflammatory treatment.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5177
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-8a6ffc3f-bcf5-4c49-b95f-10a70685e6300
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xiii, 219 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen