Authors:	Xu, Dongdong
Title:	Multiresponsive Synthetic Cells, Precise Protein Micropatterns and Streptavidin-Biotin Conjugates Using the Interaction Between Ni2+-NTA and His-tagged Proteins
Online publication date:	24-Sep-2020
Year of first publication:	2020
Language:	english
Abstract:	The binding of polyhistidine tags (His-tags) in proteins to Ni2+-NTA complexes is widely used in proteins purification, biofunctionalization of surfaces and protein modification. The small size of the tag, the mild conditions of the interaction (neutral pH and in the presence of salts) as well as reversibility in the presence of chelators and lowered pH allow preserving protein activity. In this thesis, these advantageous properties of the interaction between His-tags and Ni2+-NTA complexes were used to produce multiresponsive minimal synthetic cells, precise protein micropatterns and stoichiometrically well-defined streptavidin-biotin conjugates. Minimal synthetic cells are cell-like compartments, which have been assembled from molecular building blocks and mimic certain functions of living cells. In chapter 2, a minimal synthetic cell which combines a multistimuli sensitive adhesion unit with an energy conversion module is developed, such that it can adhere to places that have the right environmental parameters for its ATP production. The multistimuli sensitive adhesion unit can sense environmental stimuli including light, pH, oxidative stress and the presence of metal ions and can regulate the adhesion of the synthetic cell to a substrate in response to these stimuli following a chemically coded logic. The adhesion unit is composed of the light and redox responsive protein interaction of iLID and Nano as well as the pH sensitive and metal ion mediated binding of protein His-tags to Ni2+-NTA complexes. The multistimuli responsive adhesion unit allows synthetic cells to self-position themselves in places under blue light illumination and no oxidative stress, with neutral pH and the presence of metal ions and carry out their light to ATP conversion function. Introducing such multiresponsive self-positioning module to synthetic cell is an important step towards their autonomy and transferable to other types synthetic cells. The precise micropatterns provide structural and functional advantages in vast technological applications as well as fundamental research. In chapter 3, I developed a method of surface patterning proteins and cells with high spatiotemporal control using green light. A layer-by-layer (LbL) protein film with a green light cleavable protein, CarH, in the first layer is produced based on Ni2+-NTA-His-tag interaction. This enables the remote release of proteins in the upper layers by exposing the film to green light with 1 µm spatial and 10 s temporal resolution. The use of green light and the specific protein interactions overcome the current limitations of UV-light and unspecific protein immobilization, which can lead to protein denaturation. Green light lithography is successfully used to produce complex patterns of different functional His-tagged proteins including fluorescent proteins as well as the cell adhesion protein fibronectin. In chapter 4, as a further step, two approaches for regulating cell adhesions in space and time with high precision have been developed based on the photocleavable CarH and the cell adhesion peptide, RGD. In the first design, which is call GREEN-ON, a protein layer of CarH was used to mask RGD, which is exposed upon green light illumination. In the second design, GREEN-OFF, the RGD sequence was integrated into the CarH protein and the protein CarH-RGD was used in the research of cell adhesion. Both designs allow for photoregulation and open new possibilities to investigate the dynamical regulation of cell adhesions. Streptavidin-biotin conjugates with precise stoichiometries are powerful for the study of molecular biology, drug delivery and biotechnology. In chapter 5, I developed an approach to form monofunctional streptavidin conjugates with precise stoichiometries and number of open binding pockets. This method relies on an iminobiotin-polyhistidine tag, which allows separating streptavidin conjugates with different numbers of tags on a Ni2+-NTA column, and later reopening binding pockets at lowered pH to introduce a second functionality. Pure fluorescently labelled mono-, di- and trivalent streptavidin-biotin conjugates prepared in this way were used for imaging biotinylated cell surface molecules with controlled clustering. Moreover, these conjugates were functionalized with a second biotinylated molecule, folic acid-biotin, to investigate the importance of multivalent binding in targeted delivery of cells. Building on this chemistry, I prepared stoichiometrically precise tetrafunctional streptavidin conjugates in chapter 6. An exemplary streptavidin conjugate with exactly one fluorescent label, one cell targeting group, one cell penetrating peptide and one drug demonstrates how each functionality contributed to overall efficacy of the drug. Such precise tetrafunctional streptavidin conjugates opens the door for combinatorial multifunctional libraries based on the well-established biotin-streptavidin interaction. In summary, the interaction between Ni2+-NTA and His-tagged proteins is a reliable chemistry, which can be applied in many contexts as shown here in the design of stimuli-responsive synthetic cells, precise protein micropatterns and streptavidin-biotin conjugates. Our work provides a potential approach for the study of chemical biology, synthetic biology and cell biology. Die Bindung von Polyhistidin-Tags (His-Tags) in Proteinen an Ni2+-NTA-Komplexe wird häufig bei der Proteinreinigung, Biofunktionalisierung von Oberflächen und Proteinmodifikation eingesetzt. Die geringe Größe des Tags, die milden Bedingungen der Wechselwirkung (neutraler pH-Wert und in Gegenwart von Salzen) sowie die Reversibilität in Gegenwart von Chelatoren und der verringerte pH-Wert ermöglichen die Erhaltung der Proteinaktivität. In dieser Arbeit wurden diese vorteilhaften Eigenschaften der Wechselwirkung zwischen His-Tags und Ni2+-NTA-Komplexen verwendet, um multiresponsive minimale synthetische Zellen, präzise Proteinmikromuster und stöchiometrisch gut definierte Streptavidin-Biotin-Konjugate herzustellen Minimale synthetische Zellen sind zellähnliche Kompartimente, die aus molekularen Bausteinen zusammengesetzt werden und bestimmte Funktionen lebender Zellen nachahmen. In Kapitel 2 wird eine minimale synthetische Zelle entwickelt, die eine multistimuli-empfindliche Adhäsionseinheit mit einem Energieumwandlungsmodul kombiniert, so dass sie an Orten haften kann, die die richtigen Umgebungsparameter für ihre ATP-Produktion aufweisen. Die multistimuli-empfindliche Adhäsionseinheit kann Umweltreize wie Licht, pH-Wert, oxidativen Stress und das Vorhandensein von Metallionen erfassen und die Adhäsion der synthetischen Zelle an ein Substrat als Reaktion auf diese Reize nach einer chemisch codierten Logik regulieren. Die Adhäsionseinheit besteht aus der auf Licht und Redox-reagierenden Proteinwechselwirkung von iLID und Nano sowie der pH-sensitiven und Metallionen-vermittelten Bindung von Protein-His-Tags an Ni2+-NTA-Komplexe. Die auf Multistimuli ansprechende Adhäsionseinheit ermöglicht es synthetischen Zellen, sich an Orten unter Blaulichtbeleuchtung und ohne oxidativen Stress mit neutralem pH-Wert und Vorhandensein von Metallionen selbst zu positionieren und ihre Licht-ATP-Umwandlungsfunktion auszuführen. Die Einführung eines solchen multiresponsiven Selbstpositionierungsmoduls in synthetische Zellen ist ein wichtiger Schritt in Richtung ihrer Autonomie und auf andere Arten synthetischer Zellen übertragbar. Die präzisen Mikromuster bieten strukturelle und funktionelle Vorteile in großen technologischen Anwendungen sowie in der Grundlagenforschung. In Kapitel 3 entwickelte ich eine Methode zur Oberflächenstrukturierung von Proteinen und Zellen mit hoher räumlich-zeitlicher Kontrolle unter Verwendung von grünem Licht. Ein Schicht-für-Schicht (LbL)-Proteinfilm mit einem durch grünes Licht spaltbaren Protein, CarH, in der ersten Schicht wird basierend auf der Ni2+-NTA-His-Tag-Wechselwirkung hergestellt. Dies ermöglicht die Fernfreisetzung von Proteinen in den oberen Schichten, indem der Film grünem Licht mit einer räumlichen Auflösung von 1 µm und einer zeitlichen Auflösung von 10 s ausgesetzt wird. Die Verwendung von grünem Licht und die spezifischen Proteinwechselwirkungen überwinden die derzeitigen Einschränkungen von UV-Licht und unspezifischer Proteinimmobilisierung, die zur Denaturierung von Proteinen führen können. Die Grünlichtlithographie wird erfolgreich verwendet, um komplexe Muster verschiedener funktioneller His-markierter Proteine zu erzeugen. In Kapitel 4 wurden als weiterer Schritt zwei Ansätze zur hochpräzisen Regulierung von Zelladhäsionen in Raum und Zeit entwickelt, die auf dem photospaltbaren CarH und dem Zelladhäsionspeptid RGD basieren. In dem ersten Design, das als GREEN-ON bezeichnet wird, wurde eine Proteinschicht aus CarH verwendet, um RGD zu maskieren, die bei Beleuchtung mit grünem Licht belichtet wird. Im zweiten Design, GREEN-OFF, wurde die RGD-Sequenz in das CarH integriert und das Protein CarH-RGD wurde zur Erforschung der Zelladhäsion verwendet. Beide Designs ermöglichen eine Photoregulation und eröffnen neue Möglichkeiten zur Untersuchung der dynamischen Regulation von Zelladhäsionen. Streptavidin-Biotin-Konjugate mit präzisen Stöchiometrien eignen sich hervorragend für das Studium der Molekularbiologie, Arzneimittelabgabe und Biotechnologie. In Kapitel 5 entwickelte ich einen Ansatz zur Bildung monofunktioneller Streptavidin-Konjugate mit präzisen Stöchiometrien und der Anzahl offener Bindungstaschen. Dieses Verfahren beruht auf einer Iminobiotin-Polyhistidin-Markierung, die es ermöglicht, Streptavidin-Konjugate mit unterschiedlicher Anzahl von Markierungen auf einer Ni2+-NTA-Säule abzutrennen und später Bindungstaschen bei gesenktem pH wieder zu öffnen, um eine zweite Funktionalität einzuführen. Reine fluoreszenzmarkierte mono-, di- und dreiwertige Streptavidin-Biotin-Konjugate, die auf diese Weise hergestellt wurden, wurden zur Abbildung biotinylierter Zelloberflächenmoleküle mit kontrollierter Clusterbildung verwendet. Darüber hinaus wurden diese Konjugate mit einem zweiten biotinylierten Molekül, Folsäure-Biotin, funktionalisiert, um die Bedeutung der multivalenten Bindung für die gezielte Abgabe von Zellen zu untersuchen. Aufbauend auf dieser Chemie habe ich in Kapitel 6 stöchiometrisch präzise tetrafunktionelle Streptavidin-Konjugate hergestellt. Ein beispielhaftes Streptavidin-Konjugat mit genau einer fluoreszierenden Markierung, einer Zellzielgruppe, einem zellpenetrierenden Peptid und einem Arzneimittel zeigt, wie jede Funktionalität zur Gesamtwirksamkeit des Arzneimittels beitrug. Solche präzisen tetrafunktionellen Streptavidin-Konjugate öffnen die Tür für kombinatorische multifunktionale Bibliotheken, die auf der gut etablierten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung basieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wechselwirkung zwischen Ni2+-NTA und His-markierten Proteinen eine zuverlässige Chemie, die in vielen Zusammenhängen angewendet werden kann, wie hier beim Design von auf Reize ansprechenden synthetischen Zellen, präzisen Proteinmikromustern und Streptavidin-Biotin-Konjugaten gezeigt wird. Unsere Arbeit bietet einen möglichen Ansatz für das Studium der chemischen Biologie, synthetischen Biologie und Zellbiologie.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences 570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5148
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-fff3c1de-95b8-464a-8f8c-445e6885d2263
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	124 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen