Entwicklung von Markierungsstrategien für smFRET und PAL am Beispiel der DENV-NS2B-NS3-Protease und ihrer Inhibitoren
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
License
Abstract
Das sich global ausbreitende Dengue Virus (DENV) stellt besonders für Bevölkerungs¬gruppen der Subtropen und Tropen eine große Herausforderung dar, da es bis heute keine spezifische medikamentöse Therapie gibt. Eine entscheidende Rolle bei der Virusreplikation spielt die DENV NS2B NS3 Protease, welche ein viel-ver¬sprechender Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Medikamente ist. Ein möglicherweise therapeutisch nutzbarer Angriffspunkt an der Protease ist eine allosterische Bindetasche, deren Funktion und Bedeutung noch unbekannt ist. Für eine erfolgreiche Wirkstoffentwicklung ist dabei die Aufklärung des genauen Bindemodus eines nicht kompetitiven Inhibitors durch Co Kristallisation oder Photo¬affinitäts¬markierung unerlässlich. Ein tiefgründiges Verständnis der Kinetik der Liganden Bindung und den Einfluss der bekannten offenen und geschlossenen Konformationen der DENV NS2B NS3 Protease kann zudem die rationale Wirkstoffentwicklung verbessern.
In dieser Arbeit wurden die Grundvoraussetzungen geschaffen, um Konformations-dynamiken sowie Assoziations und Dissoziationskonstanten von kompetitiven und nicht kompetitiven Inhibitoren mittels Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energie-Transfer (smFRET) zu beschreiben. Hierfür wurden in einem ersten Projekt verschiedene Cystein¬mutanten der DENV NS2B NS3 Protease (G14C, S79C, S79C G14C, S79C S158C) selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Durch Optimierung der Farbstoff¬markierung an der Wildtyp Protease konnte die unspezifische Farbstoff¬markierung soweit verringert werden, dass diese die smFRET Messungen nicht beeinflussten. Studien der Kooperationspartner bestätigten unterschiedliche Konformationen der Protease in Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors (geschlossen) und eines nicht kompetitiven Inhibitors (offen). In einem assoziierten Projekt wurden zudem nicht kompetitive Inhibitoren mit funktionellen Gruppen modifiziert (Alkine, Carbonsäuren, Amine und Thiole), welche eine effiziente Umsetzung mit dem Fluoreszenzfarbstoff ermöglichen. Mittels Thiol Maleimid-Reaktion gelang es, einen farbstoffmarkierten nicht kompetitiven Inhibitor zu entwickeln.
Zur Aufklärung des tatsächlichen Bindemodus nicht kompetitiver Inhibitoren wurden des Weiteren Liganden mit einer photoreaktiven Gruppe synthetisiert und bezüglich der inhibitorischen Eigenschaften sowie der kinetischen Eigenschaften nach UV Bestrahlung untersucht. Mit diesen Liganden können Photoaffinitätsmarkierungen an der DENV NS2B NS3 Protease durchgeführt werden, um zu evaluieren, welche Aminosäuren der allosterischen Bindetasche an der Inhibitor Interaktion beteiligt sind.