Authors:	Gellert, Andrea
Title:	Entwicklung von Markierungsstrategien für smFRET und PAL am Beispiel der DENV-NS2B-NS3-Protease und ihrer Inhibitoren
Online publication date:	17-Sep-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Das sich global ausbreitende Dengue Virus (DENV) stellt besonders für Bevölkerungs¬gruppen der Subtropen und Tropen eine große Herausforderung dar, da es bis heute keine spezifische medikamentöse Therapie gibt. Eine entscheidende Rolle bei der Virusreplikation spielt die DENV NS2B NS3 Protease, welche ein viel-ver¬sprechender Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Medikamente ist. Ein möglicherweise therapeutisch nutzbarer Angriffspunkt an der Protease ist eine allosterische Bindetasche, deren Funktion und Bedeutung noch unbekannt ist. Für eine erfolgreiche Wirkstoffentwicklung ist dabei die Aufklärung des genauen Bindemodus eines nicht kompetitiven Inhibitors durch Co Kristallisation oder Photo¬affinitäts¬markierung unerlässlich. Ein tiefgründiges Verständnis der Kinetik der Liganden Bindung und den Einfluss der bekannten offenen und geschlossenen Konformationen der DENV NS2B NS3 Protease kann zudem die rationale Wirkstoffentwicklung verbessern. In dieser Arbeit wurden die Grundvoraussetzungen geschaffen, um Konformations-dynamiken sowie Assoziations und Dissoziationskonstanten von kompetitiven und nicht kompetitiven Inhibitoren mittels Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energie-Transfer (smFRET) zu beschreiben. Hierfür wurden in einem ersten Projekt verschiedene Cystein¬mutanten der DENV NS2B NS3 Protease (G14C, S79C, S79C G14C, S79C S158C) selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Durch Optimierung der Farbstoff¬markierung an der Wildtyp Protease konnte die unspezifische Farbstoff¬markierung soweit verringert werden, dass diese die smFRET Messungen nicht beeinflussten. Studien der Kooperationspartner bestätigten unterschiedliche Konformationen der Protease in Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors (geschlossen) und eines nicht kompetitiven Inhibitors (offen). In einem assoziierten Projekt wurden zudem nicht kompetitive Inhibitoren mit funktionellen Gruppen modifiziert (Alkine, Carbonsäuren, Amine und Thiole), welche eine effiziente Umsetzung mit dem Fluoreszenzfarbstoff ermöglichen. Mittels Thiol Maleimid-Reaktion gelang es, einen farbstoffmarkierten nicht kompetitiven Inhibitor zu entwickeln. Zur Aufklärung des tatsächlichen Bindemodus nicht kompetitiver Inhibitoren wurden des Weiteren Liganden mit einer photoreaktiven Gruppe synthetisiert und bezüglich der inhibitorischen Eigenschaften sowie der kinetischen Eigenschaften nach UV Bestrahlung untersucht. Mit diesen Liganden können Photoaffinitätsmarkierungen an der DENV NS2B NS3 Protease durchgeführt werden, um zu evaluieren, welche Aminosäuren der allosterischen Bindetasche an der Inhibitor Interaktion beteiligt sind. The globally expanding dengue virus (DENV) represents a major challenge, especially for populations in subtropical and tropical regions, as there is no specific drug therapy available to the present day. The DENV NS2B NS3 protease plays a key role in viral replication and is a promising target for the development of new drugs. One approach to influence the protease is the interaction of inhibitors with an allosteric binding pocket, of which the original function and relevance is still unknown. Determination of the exact binding mode of a non competitive inhibitor by co crystallization or photo¬affinity labeling is essential for successful drug development. A profound understanding of ligand binding kinetics and the influence of the known open and closed DENV NS2B NS3 protease conformation can also accelerate rational drug development. In this thesis, the prerequisites to describe conformational dynamics as well as association and dissociation dynamics of competitive and non competitive inhibitors by single molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET), were created. In a first project, different cysteine mutants of the DENV NS2B NS3 protease (G14C, S79C, S79C G14C, S79C S158C) were selectively labelled with fluorescent dyes. Non specific labeling with the fluorescent dye was reduced to a level where it did not affect smFRET measurements, by optimizing labeling conditions using the wildtype protease. Studies of the collaboration partners confirmed different conformations of the protease in the presence of a competitive inhibitor (closed) and a non competitive inhibitor (open). In an associated project, non competitive inhibitors were modified with functional groups (alkynes, carboxylic acids, amines and thiols) facilitating an efficient reaction with the fluorescent dye. A dye labelled non competitive inhibitor was developed utilizing a thiol maleimide reaction. In order to determine the actual binding mode of non competitive inhibitors, ligands with a photoreactive group were synthesized and investigated with regard to their inhibitory and kinetic properties after UV irradiation. With these ligands in hand, photoaffinity labeling to the DENV NS2B NS3 protease can be performed to evaluate which amino acids of the allosteric binding are involved in inhibitor-protease-interaction.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-5138
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-6d0856d7-c045-484c-a7de-72e4188fa9c59
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XXIII, 247 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen