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Authors: Grimmelsmann, Tim Albert
Title: Biochemical and biophysical characterization of the human TIM/TIPIN/CRY complex - a potential direct link between the circadian clock and the cell cycle
Online publishing date: 6-Aug-2020
Language : english
Abstract: The circadian clock controls the behavior of many lifeforms and is functionally connected to DNA replication and DNA damage response. Central circadian regulators influence cell cycle and DNA damage response by altering protein expression of regulatory factors or by interacting with them. The central circadian repressor CRY interacts with the TIM/TIPIN complex, that is involved in signaling of stalled replication forks and DNA damage. CRY affects TIMs’ ability to activate the CHK1 kinase which in turn leads to activation of cell cycle checkpoints and repair of DNA damage. It is not clear how the interaction is achieved, whether there is a direct interaction of both proteins or if they are parts of a larger complex. With purified proteins we showed that CRY bound TIM/TIPIN in a direct manner and formed a stoichiometric trimeric complex. We found that the two human CRY paralogs (CRY1 and CRY2) differ in their affinity to TTP and that CRY2 bound with higher affinity. This was possibly due to the highly variable tails between CRY1 and CRY2 as most divergent feature between CRY1 and CRY2. We furthermore confirmed data from literature, that the TIM NTerminus is sufficient to bind CRY. A functionally undescribed loop within TIM was dispensable for CRY binding, but caused both CRYs to bind with different affinities, indicating a further regulatory detail. Using Small-Angle X-Ray scattering and Crosslink MS, we created a hypothetical model to visualize the interaction of CRY and TIM. Initial pulldown experiments identified candidate proteins that might be affected by the TIM loop. The observation of a direct trimeric complex of TTP/CRY indicates that CRY and TIM/TIPIN functionally connect the circadian clock with signaling of DNA damage and replication stress. Different binding affinities of CRY1 and CRY2 to TTP give a hint in order to understand functional differences between the CRY paralogs and indicate functional importance of the Cterminal CRY tails. The TIM loop was not functionally described before and its effect on CRY binding could indicate an additional regulatory detail. The candidate proteins identified in a TIM loop dependent pulldown could serve as a starting point for functional characterization of the TIM loop.
Die innere Uhr beeinflusst das Verhalten vieler Lebensformen und ist funktionell verbunden mit der DNA Replikation und der zellulären Reaktion auf DNA Schäden. Circadiane Regulatoren können auf diese Prozesse Einfluss nehmen, indem sie die Biosynthese von daran beteiligten Proteinen steuern oder direkt mit diesen interagieren. Der zentrale circadiane Repressor CRY interagiert mit dem TIM/TIPIN Komplex, der in die Signaltransduktion von stockenden Replikationsgabeln und DNA Schäden involviert ist. CRY kann TIMs Fähigkeit, die CHK1 Kinase zu aktivieren, beeinflussen. Nach Aktivierung der CHK1 Kinase, aktiviert CHK1 Prozesse wie den Zellzyklusarrest in der S-Phase und DNA Reparatur. Es ist unklar, wie die Interaktion von CRY und TIM/TIPIN reguliert ist und ob es sich um eine direkte Interaktion handelt oder ob sie Teile eines gemeinsamen großen Komplexes sind. Mit isolierten Proteinen konnten wir zeigen, dass CRY TIM/TIPIN direkt band und einen trimeren Komplex bildete. Wir haben beobachtet, dass sich die beiden CRY Paraloge (CRY1 und CRY2) in ihrer Affinität zu TIM/TIPIN unterschieden und dass CRY2 mit einer höheren Affinität band. Dieser Effekt war möglicherweise auf die flexiblen C-terminalen Anhänge von CRY zurückzuführen, die sich zwischen CRY1 und CRY2 stark unterscheiden. Wir vermuten, dass dieser Unterschied auf unterschiedliche Interaktionen des CRY Anhangs mit einer bisher funktionell unbeschriebenen Proteinschleife von TIM zurückzuführen ist. Diese Proteinschleife war für die Bindung an CRY nicht essentiell und ihre Deletion verursachte, dass die CRY Proteine TIM/TIPIN mit gleicher Affinität banden. Mit Hilfe von Small-Angle X-Ray Scattering und Crosslink Massenspektrometrie Daten erstellten wir ein hypothetisches Modell für einen CRY/TIM Komplex. Initiale Pulldown Experimente konnten Kandidatenproteine identifizieren, welche durch die TIM Proteinschlaufe beeinflusst werden könnten. Die Beobachtung des direkten trimeren Komplexes zwischen CRY und TIM/TIPIN deutet an, dass diese Proteine eine direkte Verbindung zwischen der inneren Uhr und der zellulären Reaktion auf DNA Schäden und Replikationsstress darstellen. Unterschiedliche Bindungsaffinitäten zwischen den CRY Paralogen und TIM/TIPIN lassen funktionelle Unterschiede vermuten und geben einen Hinweis auf die funktionelle Bedeutung der Cterminalen CRY Anhänge. Die TIM Proteinschleife wurde bisher nicht funktionell beschrieben, und ihr Effekt auf die CRY Bindung könnte ein weiteres regulatorisches Detail darstellen. Die im Pulldown identifizierten Kandidatenproteine könnten als Ausgangspunkt für eine weitere funktionelle Charakterisierung der TIM Proteinschlaufe dienen.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use:
Extent: XII, 182 Blätter
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