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Authors: Spiecker, Lisa
Advisor: Kleinert, Hartmut
Title: Die Modulation der Hämatopoese durch das Enzym Paraoxonase-2
Online publishing date: 14-Jul-2020
Language : german
Abstract: Der intrazelluläre Level reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Genexpression, verschiedener Zellschicksalsentscheidungen und der Differenzierung, einschließlich der Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) unter sowohl physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen. Das intrazelluläre Enzym Paraoxonase-2 (PON2) ist für seine anti-oxidative und anti-apoptotische Funktion, unter anderem in der Leukämie bekannt. Das Enzym ist im endoplasmatischen Retikulum sowie den Mitochondrien lokalisiert, wo es eine essentielle Bedeutung in der Steuerung der ROS-Produktion innehat. Dies steht im Einklang mit der Assoziation von PON2 mit dem Therapieansprechen in pädiatrischer akuter lymphatischer Leukämie (ALL) sowie Imatinib-Resistenz in Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML). Diese Verbindung sowie der bekannte Einfluss des Redox-Signalings auf die Quieszenz, Apoptose, Differenzierung und Selbsterneuerung von HSCs führte zu der Vermutung, dass PON2 die Hämatopoese reguliert und durch Redox-vermittelte Mechanismen an der Steuerung der HSC-Funktion beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals beschrieben, dass eine PON2-Defizienz in vivo sowohl zu quantitativen als auch zu morphologischen und funktionellen Veränderungen hämatopoetischer Zellen führt. Durchflusszytometrische Analysen der Milz-, Thymus- und Knochenmarkzellen von PON2-/--Tieren enthüllten eine gestörte Immunzellreifung in den lymphatischen Organen und veränderte Zellzahlen hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark, mit deutlich ausgeprägtem myeloid skewing in über 9 Monate alten Tieren. Labormedizinische Untersuchungen des Blutes zeigten quantitativ unveränderte, jedoch morphologisch auffällige Erythrozyten mit veränderter zellulärer Hämoglobinkonzentration sowie vergrößerte und quantitativ veränderte Thrombozyten. Des Weiteren wurden Veränderungen in der myeloid/lymphoid-Verteilung der zellulären Bestandteile des Blutes alter PON2-/--Tiere aufgedeckt. Die Untersuchungen reziprok transplantierter Chimären demonstrierten, dass die aufgedeckten Effekte hauptsächlich auf intrazelluläres Signaling und nicht auf Nischeneffekte zurückzuführen sind. Weiterführende Analysen auf zellspezifischem Level zeigten erhöhte ROS- bzw. Superoxid-Level, verringerte Apoptoseraten sowie unveränderte DNA-Schädigung in hämatopoetischen Zellen PON2-defizienter Mäuse. Anschließend durchgeführte funktionelle Analysen der HSPCs offenbarten eine gesteigerte Repopulationsfähigkeit der PON2-/--Zellen, die weder von Änderungen im Zellzyklus, der Klonogenität oder der Zielfindungsfähigkeit abgeleitet werden konnte. Insgesamt wiesen die Resultate dieser Arbeit auf eine Rolle der PON2 in der Reifung von Erythrozyten, Thrombozyten und Lymphozyten sowie in der Differenzierung und Funktionalität von HSPCs hin. Dementsprechend wiesen die Resultate der verschiedenen Analysen PON2-defizienter Tiere auf multiple Differenzierungsblockaden in hämatopoetischen Zellen, sowie auf verschiedene Kompensationsmechanismen, die der Vorbeugung erhöhter Apoptoseraten sowie frühzeitigem Funktionsverlust von HSPCs, verursacht durch erhöhte ROS-Level, dienten, hin. Jene Mechanismen erschienen in alten PON2-/--Tieren so stark ausgeprägt, dass von einem prä-leukämischen Stadium in den HSCs ausgegangen werden konnte. Bei der genaueren Betrachtung aller Veränderungen, die bedingt durch die PON2-Defizienz im Laufe des Alterungsprozesses festgestellt wurden, konnte eine frühzeitige Stammzellalterung diagnostiziert werden und eine weiterführende Prüfung der Verwendbarkeit von PON2-/--Tieren als Stammzell-Alterungsmodell vorgeschlagen werden.
The intracellular level of reactive oxygen species (ROS) plays an important role in regulating gene expression, different cell fate decisions as well as cell differentiation, including differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs) under physiological and pathophysiological conditions. The intracellular enzyme paraoxonase-2 (PON2) is known for its anti-oxidative and anti-apoptotic properties, amongst others in leukemia. The enzyme is located in the endoplasmic reticulum as well as in mitochondria, where it plays a key role in controlling ROS production. This is in line with the association of PON2 levels with response to front-line therapies in pediatric acute lymphoid leukemia (ALL) and imatinib resistance in chronic myeloid leukemia (CML) patients. These findings and the known impact of redox signaling on quiescence, apoptosis, differentiation and self-renewal of hematopoietic stem cells (HSCs) led to the assumption, that PON2 regulates hematopoiesis and is involved in controlling HSC function through redox mediated mechanisms. In this work it is reported for the first time, that PON2 deficiency in vivo leads to quantitative as well as morphological and functional changes in hematopoietic cells. Flow cytometric analysis of spleen, thymus and bone morrow cells from PON2-/- animals revealed impaired immune cell maturation in lymphatic organs and modified cell count of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in bone marrow, with pronounced myeloid skewing in more than 9 months old animals. Clinical laboratory testing of blood samples uncovered quantitative unaltered but morphologically abnormal erythrocytes with altered intracellular hemoglobin concentration as well as enlarged and quantitative altered thrombocytes. Furthermore, changes in the myeloid/lymphoid ratio of the cellular blood components of aged PON2-/- animals were detected. Examination of reciprocal transplanted chimeras demonstrated, that most of the uncovered effects are attributable to intracellular signaling rather than mixed effects. In-depth analyses on a cell specific level revealed elevated total ROS and superoxide levels, decreased apoptotic rates as well as unaltered DNA damage in hematopoietic cells of PON2 deficient mice. Subsequent functional analysis of HSPCs disclosed increased repopulation ability of PON2-/- cells that could not be derived from changes in cell cycle, clonogenicity or homing ability. Overall, these findings point to an important role of PON2 in maturation of erythrocytes, thrombocytes and lymphocytes as well as in differentiation and functionality of HSPCs. Accordingly, the results of all analysis performed on PON2 deficient animals indicate multiple differentiation blockages in hematopoietic cells as well as different compensation mechanisms, that prevent increased apoptotic rates as well as premature loss of function in HSPCs, caused by elevated ROS levels. In aged PON2-/- animals, those mechanisms seemed to be so pronounced, that a pre-leukemic state in this HSCs can be assumed. Closer inspection of all modifications due to PON2 deficiency that occur during aging, enables to diagnose premature stem cell aging and proposes further assessment of PON2-/- animals as potential future stem cell aging model.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
570 Biowissenschaften
570 Life sciences
590 Tiere (Zoologie)
590 Zoological sciences
610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International
Information on rights of use: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
Extent: 198 Seiten
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