Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4851
Authors: Lerch, Simone
Title: Uptake mechanism, intracellular trafficking and endo-lysosomal pH monitoring of polystyrene nanoparticles
Online publication date: 13-Feb-2012
Language: english
Abstract: What is the intracellular fate of nanoparticles (NPs) taken up by the cells? This question has been investigated for polystyrene NPs of different sizes with a set of molecular biological and biophysical techniques.rnTwo sets of fluorescent NPs, cationic and non-ionic, were synthesized with three different polymerization techniques. Non-ionic particles (132 – 846 nm) were synthesized with dispersion polymerization in an ethanol/water solution. Cationic NPs with 120 nm were synthesized by miniemulsion polymerization Particles with 208, 267 and 603 nm were produced by seeding the 120 nm particle obtained by miniemulsion polymerization with drop-wise added monomer and polymerization of such. The colloidal characterization of all particles showed a comparable amount of the surface groups. In addition, particles were characterized with regard to their size, morphology, solid content, amount of incorporated fluorescent dye and zeta potential. The fluorescent intensities of all particles were measured by fluorescence spectroscopy for calibration in further cellular experiments. rnThe uptake of the NPs to HeLa cells after 1 – 24 h revealed a much higher uptake of cationic NPs in comparison to non-ionic NPs. If the same amount of NPs with different sizes is introduced to the cell, a different amount of particles is present in the cell medium, which complicates a comparison of the uptake. The same conclusion is valid for the particles’ overall surface area. Therefore, HeLa cells were incubated with the same concentration, amount and surface area of NPs. It was found that with the same concentration always the same polymer amount is taking up by cells. However, the amount of particles taken up decreases for the biggest. A correlation to the surface area could not be found. We conclude that particles are endocytosed by an excavator-shovel like mechanism, which does not distinguish between different sizes, but is only dependent on the volume that is taken up. For the decreased amount of large particles, an overload of this mechanism was assumed, which leads to a decrease in the uptake. rnThe participation of specific endocytotic processes has been determined by the use of pharmacological inhibitors, immunocytological staining and immunofluorescence. The uptake of NPs into the endo-lysosomal machinery is dominated by a caveolin-mediated endocytosis. Other pathways, which include macropinocytosis and a dynamin-dependent mechanism but exclude clathrin mediated endocytosis, also occur as competing processes. All particles can be found to some extent in early endosomes, but only bigger particles were proven to localize in late endosomes. No particles were found in lysosomes; at least not in lysosomes that are labeled with Lamp1 and cathepsin D. However, based on the character of the performed experiment, a localization of particles in lysosomes cannot be excluded.rnDuring their ripening process, vesicles undergo a gradual acidification from early over late endosomes to lysosomes. It is hypothesized that NPs in endo-lysosomal compartments experience the same change in pH value. To probe the environmental pH of NPs after endocytosis, the pH-sensitive dye SNARF-4F was grafted onto amino functionalized polystyrene NPs. The pH value is a ratio function of the two emission wavelengths of the protonated and deprotonated form of the dye and is hence independent of concentration changes. The particles were synthesized by the aforementioned miniemulsion polymerization with the addition of the amino functionalized copolymer AEMH. The immobilization of SNARF-4F was performed by an EDC-coupling reaction. The amount of physically adsorbed dye in comparison to covalently bonded dye was 15% as determined by precipitation of the NPs in methanol, which is a very good solvent for SNARF-4F. To determine influences of cellular proteins on the fluorescence properties, a intracellular calibration fit was established with platereader measurements and cLSM imaging by the cell-penetrable SNARF-4F AM ester. Ionophores equilibrated the extracellular and intracellular pH.rnSNARF-4F NPs were taken up well by HeLa cells and showed no toxic effects. The pH environment of SNARF-4F NPs has been qualitatively imaged as a movie over a time period up to 1 h in pseudo-colors by a self-written automated batch program. Quantification revealed an acidification process until pH value of 4.5 over 24 h, which is much slower than the transport of nutrients to lysosomes. NPs are present in early endosomes after min. 1 h, in late endosomes at approx. 8 h and end up in vesicles with a pH value typical for lysosomes after > 24 h. We therefore assume that NPs bear a unique endocytotic mechanism, at least with regards to the kinetic involvedrn
Welches ist das intrazelluläre Schicksal von Nanopartikeln (NPs), nachdem sie von Zellen aufgenommen wurden? Diese Frage wurde für Polystyrol-NP unterschiedlicher Größe untersucht.rnZwei Reihen fluoreszenter NPs, kationisch und nicht-ionisch stabilisiert, wurden mit drei versch. Polymerisationsmethoden synthetisiert. Nicht-ionische Partikel (132 – 846 nm) wurden mit der Dispersionspolymerisation in einer Ethanol/Wasser-Lösung hergestellt. Kationische NPs mit einem Durchmesser von 120 nm wurden über die Miniemulsionspolymerisation synthetisiert. Kationische Partikel mit 208, 267 und 603 nm wurden über tropfenweise Zugabe von Styrolmonomer zu 120 nm großen Seedpartikeln, welche mit Hilfe der Miniemulsionspolymerization hergestellt wurden, erlangt. Alle Partikel tragen eine ähnliche Anzahl an geladenen Gruppen auf der Oberfläche tragen. Zusätzlich wurden die NPs nach ihrer Größe, Morphologie, Feststoffgehalt, Menge an eingebrachtem Fluoreszenzfarbstoff und Zetapotential charakterisiert. Die Fluoreszenzintensität wurde über Fluoreszenzspektroskopie bestimmt, um für spätere Zellexperimente als Kalibration zu dienen.rnDie Aufnahme von NP nach 1 – 24 h Inkubationszeit zeigte, dass kationische Partikel deutlich besser in HeLa-Zellen aufgenommen werden als nicht-ionische NPs. Wird dieselbe Menge NPs unterschiedlicher Größe den Zellen dargeboten, ist eine ungleiche Anzahl an sowie Gesamtoberfläche der Partikel im Zellmedium vorhanden, was den direkten Vergleich der Aufnahme kompliziert. Deshalb wurden HeLa-Zellen mit der gleichen Polymerkonzentration, der gleichen Anzahl an Partikeln sowie der gleichen Gesamtoberfläche inkubiert. Es stellte sich heraus, dass bei gleicher Konzentration immer die gleiche Menge an Polymer aufgenommen wird. Allerdings nahm die Aufnahme der Partikelanzahl für den größten Partikel mit 603 nm ab. Eine Korrelation der Aufnahme zur Oberfläche konnte nicht gefunden werden. Schlussfolgernd werden NPs über einen baggerschaufelartigen Mechanismus aufgenommen, der nicht zwischen Partikelgrößen unterscheidet und allein vom Aufnahmevolumen abhängt. Für die Abnahme der Aufnahme des größten Partikels wirdeine Überladung des Mechanismus‘ angenommen, der zu einer verhältnismäßig reduzierten Anzahl großer NPs in der Zelle führt. rnDie Beteiligung von spezifischen Endozytoseprozessen wurde über den Einsatz pharmakologischer Inhibitor, immunzytologischer Färbung sowie Immunfluoreszenz bestimmt. Die Aufnahme von NPs in die endo-lysosomale Maschinerie wird von caveolin-verm. Endozytose dominiert. Andere Wege, welche Makropinozytose und einen dynamin-abhängigen Mechanismus ein-, aber clathrin-verm. Endozytose ausschließen, kamen auch als konkurrierende Prozesse vor. Alle Partikel waren zu einem kleinen Anteil in frühen Endosomen (EEs) zu finden, aber nur größere Partikel kommen in späten Endosomen (LEs) vor. Partikel wurden nicht in Lysosomen gefunden; zumindest nicht in Lysosomen, welche mit Lamp1 und Cathepsin D markiert waren. rnWährend des Reifungsprozesses von frühen über späten Endosomen zu Lysosomen durchlaufen Vesikel eine graduelle Ansäuerung. Es wird angenommen, dass NPs in endo-lysosomalen Kompartimenten eine vergleichbare Veränderung des pH-Werts erfahren. Um den Umgebungs-pH-Wert von NPs nach der Endozytose zu bestimmen, wurde der pH-sensitive Farbstoff SNARF-4F auf aminofunkt. Polystyrolpartikel aufgebracht. Der pH-Wert ist eine Quotientenfunktion der beiden Emissionsbereiche der protonierten und deprotonierten Form des Farbstoffs und ist somit unabhängig von Konzentrationsänderungen. Die Partikel wurden mit der zuvor erwähnten Miniemulsionspolymerisation unter Beteiligung eines aminofunkt. Copolymers synthetisiert. Die Immobilisierung von SNARF-4F erfolgte über eine EDC-Kopplungsreaktion. Die Menge an physikalisch adsorbiertem Farbstoff im Vergleich zu kovalent gebundenem betrug 15%, wie über Fällung der Partikel in Methanol, welches ein sehr gutes Lösungsmittel für SNARF-4F darstellt, ermittelt wurde. Um den Einfluss von zellulären Bestandteilen auf die Fluoreszenzeigenschaften zu determinieren, wurde ein intrazellulärer Kalibrationsfit mit dem zelldurchlässigen SNARF-4FAM-Ester etabliert. Ionophoren äquilibrierten dazu den extrazellulären und intrazellulären pH-Wert.rnSNARF-4F NPs wurden gut von HeLa-Zellen aufgenommen und zeigten keine toxischen Effekte. Die von SNARF-4F NPs gemessenen pH-Werte wurden qualitativ zeitabhängig aufgenommen und von einem selbstgeschriebenen automatischen batch-Bearbeitungsproramm umgesetzt. Eine Quantifizierung offenbarte, dass der Ansäuerungsprozess bis zu einem pH von 4,5 über 24 h andauert, was sehr viel langsamer ist als die Ansäuerung von Nährstoffen in Lysosomen. NPs sind nach mindestens 1 h in EEs auffindbar; in LEs nach ca. 8 h und nach > 24 h in Lysosomen. NPs im endo-lysosomalen System besitzen daher einen einzigartige Reifungsprozess.
DDC: 540 Chemie
540 Chemistry and allied sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: MaxPlanck GraduateCenter
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4851
URN: urn:nbn:de:hebis:77-30114
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 155 S.
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