Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4849
Authors: Kibrom, Asmorom Afewerki
Title: A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy
Online publication date: 18-Oct-2010
Language: english
Abstract: Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.
The transmembrane potential difference Δϕm is closely associated to the catalytic activity of cytochrome c oxidase (CcO). CcO is the terminal enzyme ( complex IV) in the electron transport chain of the mitochondria. The enzyme catalyzes the reduction of O2 to 2 H2O, thereby electrons are transferred from cytochrome c to CcO. Electron transfer within the CcO is coupled to proton translocation. Consequently, a difference in proton concentration over the inner mitochondrial membrane and a membrane potential difference Δϕm are generated.rnrnThe transmembrane potential Δϕm can be measured by fluorescence spectroscopy using a potential sensitive dye. Before quantitative results can be deduced from such investigations, calibration measurements using defined electrical potentials applied to the lipid membrane have to be conducted. rnrnHere, calibration measurement of Δϕm in a model membrane with CcO are presented. Δϕm is induced by defined external potentials applied to the lipid membrane. Therefore, a model membrane system called the protein-tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) was developed on the transparent, semi-conducting substrate indium tin-oxide (ITO). ITO enables simultaneous implementation of electrochemical and fluorescence or optical waveguide techniques.rnrnA thin hydrogel layer was used as a soft 'cushion' for the ptBLM on ITO, providing the nickel chelating nitrilo-triacetic acid (NTA) groups, to which CcO from Paracoccus denitrificans was bound in a well defined orientation via a his-tag attached to its subunit I. The ptBLM was then formed by in-situ dialysis using bio-beads. Electrochemical impedance spectroscopy showed good electrical sealing properties (≈ 1 MΩ). Surface plasmon resonance optical waveguide spectroscopy (SPR/OWS) indicated an increased anisotropy of the system after formation of the lipid bilayer. Cyclic voltammetry in the presence of reduced cytochrome c demonstrated that CcO was incorporated into the gel-supported ptBLM in a functionally active form. The membrane potential induced in a gel-supported ptBLM by an external voltage waveform was measured by ratiometric fluorescence spectroscopy. Reference measurements using a tethered BLM provided a conversion factor in terms of the ratiometric parameter Rn (0.05 / 100 mV). Potential changes induced in the ptBLM by external voltage were measured down to ≈ 80 mV. These data provide a basis for future investigations of the self-generated Δϕm of CcO in a ptBLM.rn
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: Externe Einrichtungen
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4849
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 155 S.
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