Authors:	Borek, Christoph
Title:	Design, Synthese und Testung potentieller Inhibitoren der Golgi-α-Mannosidase II
Online publication date:	4-Apr-2019
Year of first publication:	2019
Language:	german
Abstract:	The enzyme Golgi-α-mannosidase II (GMII) plays a crucial role in the N-glycosylation pathway, which is involved in the metastatic process of several types of cancer. It provides essential precursors of glycosyl chains which are neccesary for cell recognition through interaction with selectins on the cell surface. In different cancer cells, modified glycosylation patterns were found. Their origin is believed to be the misregulation of protein expression which leads to unnatural high concentration of glycosly transferases. In clinical trials, the reduction of metastasis and tumor growth by inhibition oft he GMII has been shown. Hence the inhibition of this enzyme represents a promising target in cancer therapy. As a new class of active substances covalent reversible inhibitors are to be developed and tested. These should combine the advantages of covalent inhibitors omitting their disadvantages. These inhibitors require extremely precise adaption of the ligand structure to its receptor and in the reactivity of the inhibitor in order to form a covalent reversible adduct with the enzyme. To predict potential inhibitors molecular docking methods and quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) methods were used. The main task of this thesis was the synthesis of these structures as well as the synthesis of fluorescent substrates to establish new assays with α-mannosidases and β-glucosidases. In total, 41 substances were synthesized. An overview of the individual subjects is shown in figure 1. In a docking assisted de-novo-design a structure (L039) was identified, to meet all identified requirements for a covalent reversible inhibition of GMII in QM/MM-calculation. In further docking studies, several structures from the substance class of monocyclic N,O-acetals were identified as potential covalent reversible inhibitors. Furthermore, investigations on a spiroacetal were carried out. In the context of this work, 25 monocyclic N,O-acetals, two derivatives of azamannose as potential building block, isofagomine and its 5-isomer, four potential inhibiors of a potential allosteric site of GMII and fragments of L039 were synthesized, purified and analysed spectrometroscopically. None of those compounds showed significant inhibition of dGMII. To investigate the activity of potential inhibitors, enzyme assays were carried out. For this task, two substrates were prepared in four- and five-steps synthesis, as well as a reference inhibitor of β-glucosidases (isofagomine) in a six-step synthesis to validate the assay systems. Die Golgi-α-Mannosidase II (GMII) spielt eine entscheidende Rolle im N-Glycosylierungsprozess. Dieser ist maßgeblich an der Metastasierung diverser Krebstumorarten beteiligt, da er essentielle Vorstufen der zur Zellerkennung notwendigen Glycosylketten bereitstellt, welche auf der Zelloberfläche mit Selectinen interagieren. Auf der Oberfläche verschiedener Krebszellen wurden modifizierte Glycosylierungsmuster nachgewiesen, als deren Ursache eine Fehlregulierung der Expression angenommen wird, die zu unnatürlich hohen Konzentrationen an Glycosyltransferasen führt. In klinischen Studien konnte die Reduzierung von Tumorwachstum und Metastasierung durch die Inhibition der GMII bereits nachgewiesen werden. Daher stellt die Inhibition dieses Enzyms einen vielversprechenden Angriffspunkt in der Krebstherapie dar. Als neue Wirkstoffklasse für die GMII sollten kovalent reversible Inhibitoren entwickelt und getestet werden, da sie die Vorteile kovalenter Inhibitoren durch Reversibilität ohne deren Nachteile kombinieren. Solche Inhibitoren bedürfen äußerst genauer Anpassung der Struktur an den Rezeptor und hinsichtlich der Reaktivität in Bezug auf die Reaktion mit dem Inhibitor zur Bildung eines kovalent reversiblen Addukts. Zur Vorhersage von potentiellen Inhibitoren wurden molekulares Docking durchgeführt sowie auf quantenmechanische und molekularmechanische (QM/MM) Simulationen zurückgegriffen. Der Kerninhalt dieser Arbeit war die Synthese dieser Verbindungen sowie die Synthese von fluorogenen Substraten für β-Glucosidasen und α-Mannosidasen. Insgesamt wurden 41 Verbindungen synthetisiert. Eine Übersicht der einzelnen Teilprojekte ist in Abbildung 1 dargestellt. In Docking-gestütztem De-Novo-Design wurde eine Struktur (L039) entwickelt, die allen zuvor durch QM/MM-Simulationen identifizierten Anforderungen an einen kovalent reversiblen Inhibitor genügte. In weiteren Dockingstudien wurden diverse Verbindungen aus der Substanzklasse der monocyclischen N,O-Acetale als poteniell kovalent reversible Inhibitoren identifiziert. Daneben wurden Untersuchungen an einem Spiroacetal durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein Spiroacetal, 25 monocyclische N,O-Acetale, zwei Derivate der Azamannose als potentielle Synthesebausteine, Isofagomin und dessen 5-Epimer, vier potentielle Inhibitoren für eine potentielle allosterische Bindetasche sowie Fragmente der Struktur L039 synthetisiert, aufgereinigt und spektroskopisch charakterisiert. Keine dieser Verbindungen zeigte signifikante Hemmung der dGMII. Zur Untersuchung der Aktivität der potentiellen Inhibitoren wurden Enzymassays durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden zwei Substrate in vier- bzw. fünfstufiger Synthese für fluorometrische Assays sowie ein Referenz-Inhibitor der β-Glucosidase (Isofagomin) in sechstufiger Synthese zur Validierung des Assays-Systems dargestellt.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4809
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000027155
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XXIV, 250 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen