Authors:	Krainer, Siegfried
Title:	Microarray based real-time analysis of nucleic acid hybridization kinetics and thermodynamics
Online publication date:	7-Jun-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Ziel dieser Dissertation ist die experimentelle Charakterisierung und quantitative Beschreibung der Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresträngen mit oberflächengebundenen Fängermolekülen für die Entwicklung von integrierten Biosensoren. Im Gegensatz zu lösungsbasierten Verfahren ist mit Microarray Substraten die Untersuchung vieler Nukleinsäurekombinationen parallel möglich. Als biologisch relevantes Evaluierungssystem wurde das in Eukaryoten universell exprimierte Actin Gen aus unterschiedlichen Pflanzenspezies verwendet. Dieses Testsystem ermöglicht es, nahe verwandte Pflanzenarten auf Grund von geringen Unterschieden in der Gen-Sequenz (SNPs) zu charakterisieren. Aufbauend auf dieses gut studierte Modell eines House-Keeping Genes wurde ein umfassendes Microarray System, bestehend aus kurzen und langen Oligonukleotiden (mit eingebauten LNA-Molekülen), cDNAs sowie DNA und RNA Targets realisiert. Damit konnte ein für online Messung optimiertes Testsystem mit hohen Signalstärken entwickelt werden. Basierend auf den Ergebnissen wurde der gesamte Signalpfad von Nukleinsärekonzentration bis zum digitalen Wert modelliert. Die aus der Entwicklung und den Experimenten gewonnen Erkenntnisse über die Kinetik und Thermodynamik von Hybridisierung sind in drei Publikationen zusammengefasst die das Rückgrat dieser Dissertation bilden. Die erste Publikation beschreibt die Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Spezifizität von Microarray Ergebnissen durch online Messung von Kinetik und Thermodynamik gegenüber endpunktbasierten Messungen mit Standard Microarrays. Für die Auswertung der riesigen Datenmengen wurden zwei Algorithmen entwickelt, eine reaktionskinetische Modellierung der Isothermen und ein auf der Fermi-Dirac Statistik beruhende Beschreibung des Schmelzüberganges. Diese Algorithmen werden in der zweiten Publikation beschrieben. Durch die Realisierung von gleichen Sequenzen in den chemisch unterschiedlichen Nukleinsäuren (DNA, RNA und LNA) ist es möglich, definierte Unterschiede in der Konformation des Riboserings und der C5-Methylgruppe der Pyrimidine zu untersuchen. Die kompetitive Wechselwirkung dieser unterschiedlichen Nukleinsäuren gleicher Sequenz und die Auswirkungen auf Kinetik und Thermodynamik ist das Thema der dritten Publikation. Neben der molekularbiologischen und technologischen Entwicklung im Bereich der Sensorik von Hybridisierungsreaktionen oberflächengebundener Nukleinsäuremolekülen, der automatisierten Auswertung und Modellierung der anfallenden Datenmengen und der damit verbundenen besseren quantitativen Beschreibung von Kinetik und Thermodynamik dieser Reaktionen tragen die Ergebnisse zum besseren Verständnis der physikalisch-chemischen Struktur des elementarsten biologischen Moleküls und seiner nach wie vor nicht vollständig verstandenen Spezifizität bei. This thesis comprises the development of a real-time measurement system for the detection of hybridization and temperature induced denaturation of surface immobilized nucleic acid including the analysis of the kinetic and thermodynamic data obtained. Based on the results from the development of the evanescence based real-time microarray reader prototype a modeling of the whole signal transfer function from the probe and target concentration to the digital output of the electronic signal path was done. Compared to solution based systems the real-time analysis of microarray formats gives the opportunity of parallel investigation of a large number of probe-target combination in parallel. For the evaluation of the prototype the Actin X-chip was designed. The Actin gene is ubiquitous expressed in the cells of all eukaryote species. Based on this gene a set of probes of different length was designed, including probes with LNA molecules incorporated. Additionally a cDNA array was prepared. Targets were realized in DNA and RNA with different labeling for optimization of signal to background ratio. Based on the results achieved, three publication have been submitted: The first describes the improvement of specificity and reproducibility of real-time measurement compared to endpoint based systems. The algorithms for the automated extraction of kinetic and thermodynamic parameters from the huge dataset are comprised in the second publication. For the modeling of the melting curves a Fermi-Dirac statistics based approach was used. To differentiate sequence effects from structural ones different types of nucleic acid (DNA, RNA, LNA) were preparated and hybridized simultaneously. This gives to opportunity for modification of the ribose and the C5-methylgroup in nucleic acid strands of the same sequence and for investigations on the impact of the chemical groups on hybridization and thermodynamics. The competitive interaction of the isosequential nucleic acid strands is described in the third publication. Beside the technological development in the field of biosensors and the algorithms for the automated analysis of the kinetics and thermodynamics this work is trying to improve the understanding of the physico-chemical behavior of the most elementary molecule of life.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4804
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-27982
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen