Authors:	Betzen, Christian
Title:	Oxidativer Stress als Modulator der NMDA-Rezeptorexpression auf zerebrovaskulären Endothelzellen
Online publication date:	8-Jul-2011
Year of first publication:	2011
Language:	german
Abstract:	Oxidativer Stress in Form reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Exzitotoxizität durch supraphysiologische Konzentrationen des Neurotransmitters Glutamat sind nicht nur beteiligt an der Pathogenese vielzähliger neurodegenerativer Erkrankungen wie Schlaganfall, Hirntrauma, Alzheimer Demenz oder Multipler Sklerose, sondern spielen zudem eine Schlüsselrolle im dort beobachteten Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke. Glutamat führt durch Stimulation neuronaler und endothelialer NMDA-Rezeptoren zu einer Generierung von ROS. Nicht verfolgt worden war bisher, welche Auswirkungen ROS umgekehrt auch auf den NMDA-Rezeptor haben könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob und in welcher Weise die Exposition gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies einen Einfluss auf die Expression und Aktivierbarkeit von NMDA-Rezeptoren auf zerebrovaskulären Endothelzellen ausübt.rnEs konnte zunächst die Expression der funktionell obligaten NR-1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors auf der verwendeten Zelllinie b.End3 mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie gesichert werden. Ein Nachweis von mRNA für die Untereinheiten NR1 und NR2B, C und D erfolgte mittels RT-PCR. In der Analyse der replizierten RNA zeigten sich Hinweise für eine heterogene Komposition der exprimierten endothelialen NMDA- Rezeptoren.rnEs konnte weiter mit Hilfe der In-Cell-Western-Technik gezeigt werden, dass die Expression des NMDA-Rezeptors durch transiente Stimulation mit reaktiven Sauerstoffspezies im Sinne einer Heraufregulation moduliert werden kann. Die Stimulation der Zellen mit den reaktiven Sauerstoffspezies O2-, ONOO- und H2O2 führte dabei im Experiment zu einer deutlichen Zunahme der NR1-Expression, die spätestens nach 72 Stunden höchst signifikant war.rnUm zu überprüfen, welche Bedeutung diese Überexpression für die Integrität der Blut-Hirn-Schranke unter den exzitotoxischen Bedingungen hoher Glutamatkonzentrationen haben könnte, wurde mit Hilfe des ECIS-Systems („Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing“) die Impedanz ROS-präexponierter Endothelmonolayer gemessen. Auf Rezeptorstimulation mit dem spezifischen Agonisten NMDA reagierten die vorbehandelten Gruppen mit einem Abfall der Impedanz gegenüber der nicht vorbehandelten Kontrolle.rnrnDie vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass ROS in der Lage sind, funktionelle endotheliale NMDA-Rezeptoren zu induzieren und auf diesem Weg zu einem verstärkten Abfall der BHS-Integrität unter den Bedingungen exzitotoxischen und oxidativen Stresses führen. Dies stellt einen neuen Mechanismus zur Erklärung der Pathogenese des Blut-Hirn-Schrankenversagens dar. Oxidative stress in the form of reactive oxygen species (ROS) and excitotoxicity caused by excessive concentrations of the neurotransmitter glutamate not only participate in the pathogenesis of diverse neurodegenerative diseases like stroke, brain trauma, Alzheimer dementia or multiple sclerosis but do also play a key role in the disruption of the blood-brain barrier observed in these pathologies. Glutamate leads to generation of ROS via stimulation of neuronal and endothelial NMDA receptors. As yet, no investigations have been conducted examining whether ROS might have influences on the NMDA receptor as well. The present study was therefore performed to establish if and in what manner exposition to ROS modulates the expression and activity of NMDA receptors on cerebrovascular endothelium.rnFirstly, expression of the NR1 subunit mandatory for functionality of NMDA the receptor was confirmed on the b.End3 cell line employed in the experiments with immunofluorescence microscopy. RT-PCR was performed to detect mRNA for the subunits NR1 as well as NR2B, C and D. Analysis of replicated RNA suggested a heterogeneous composition of expressed endothelial NMDA receptors.rnUsing the In-Cell Western technique, it was shown that transient stimulation of cells with ROS modulates NMDA receptor expression, resulting in an up-regulation of receptors. Stimulation with the reactive oxygen species O2-, ONOO- and H2O2 led to marked increase in NR1 expression, which was highly significant ( p < 0.001) after 72 hours.rnTo evaluate the impact of overexpression of NMDA receptors on the integrity of the blood-brain barrier, the ECIS system („Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing“) was used to measure the impedance of an ROS pre-exposed monolayer. Pre-treated groups reacted to stimulation using the specific agonist NMDA with a decrease in impedance as opposed to non pre-treated controls.rnrnThe results presented in this study support the hypothesis that ROS induce functional endothelial NMDA receptors and thus further disruption of blood-brain barrier integrity under conditions of excitotoxic and oxidative stress. Upregulation of NMDA receptors through the action of oxidative stress represents a novel mechanism in the pathogenesis of blood-brain barrier dysfunction.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4794
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-27846
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen