Detektion und Synthese eines liganden-gesteuerten Ionenkanals im mikrofluidischen Analysesystem
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Abstract
Membranproteine spielen eine wichtige Rolle bei physiologischen Prozessen wie
Signalweiterleitung oder Immunreaktion. Deshalb stehen sie im Fokus der
pharmakologischen Wirkstoffentwicklung und es besteht großes Interesse, Membranproteinbasierte
Biosensoren zu entwickeln,
die sich z.B. als Screening-Plattformen eignen.
Allerdings stellt die Handhabung von Membranproteinen wegen ihrer amphiphilen Struktur
eine große Herausforderung dar. Membranproteine werden meist in Zellkultur oder in
bakteriellen Expressionssystemen synthetisiert. Diese Verfahren liefern aber oft nur eine
geringe Ausbeute und erlauben wenig Kontrolle über die Expressionsbedingungen. Als
alternativer Ansatz bietet sich stattdessen die in vitro Synthese von Proteinen an, die in einer
zellfreien Umgebung stattfindet.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines miniaturisierten Analysesystems, das
Aktivitätsmessungen an in vitro synthetisierten Ionenkanälen erlaubt. Dafür wurde ein Labon-
Chip entwickelt, der elektrochemische und optische Nachweismethoden in parallelen
Anätzen ermöglicht. Als amphiphile Umgebung für die Inkorporation von Membranproteinen
wurden vier verschieden biomimetische Membranaufbauten hinsichtlich ihrer Dichtigkeit und
ihrer
Reproduzierbarkeit untersucht. Als Methode fanden insbesondere die
Impedanzspektroskpie und die Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie Anwendung.
Die peptide cushioned Bilyer Lipid Membranes (pcBLM) eignete sich dabei am besten für
Untersuchungen an Membranproteinen.
Zur Detektion der Ionenkanalaktivität wurde eine neue Messmethode etabliert, die auf der
Messung der Impedanz bei fester Frequenz basiert und u.a. eine Aussage über die Änderung
des Membranwiderstandes bei Aktivierung erlaubt. Am Beispiel des nicotinischen
Acetylcholinrezeptors (nAchR) konnte gezeigt werden, dass sich die Aktivität von
Ionenkanälen mit dem entwickelten Chip-System nachweisen ließ. Die Spezifität der Methode
konnte durch verschiedene Kontrollen wie die Zugabe eines nicht-aktivierenden Liganden
oder Inhibition des Rezeptors nachgewiesen werden.
Weiterhin konnte die in vitro Synthese des Ionenkanals a7 nAchR durch
Radioaktivmarkierung nachgewiesen werden. Die Inkorporation des Rezeptors in
die
biomimetischen Membranen wurde mit Immunodetektion und elektrochemischen Methoden
untersucht. Es zeigte sich, dass die funktionelle Inkorporation des a7 nAchR davon abhing,
welcher biomimetische Membranaufbau verwendet wurde.