Authors:	Homburg, Shirli
Title:	Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)
Online publication date:	3-May-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn The soluble epoxide hydrolase (sEH) is a member of the epoxide hydrolase family of enzymes. Its “classic” role is detoxification, by converting potentially harmful epoxides to their vicinal diols. Furthermore, its main function is the metabolism of endogenous arachidonic–acid- derived signalling molecules such as epoxyeicosatrienoic acids to the corresponding diols. Hence, the sEH has evolved as a target for therapy of hypertention, inflammation and in therapy of a growing number of other pathologies. rnThe sEH is a homodimer in which each subunit is composed of two domains. The catalytic center for the epoxide hydrolase activity is located in the 35kD C-terminal domain which has been well studied and nearly all catalytic properties of the enzyme and its known roles have been exclusively related to this part of the enzyme. In contrast, little is known about the sEH 25kD N-terminal domain. It belongs to the haloacid dehalogenases (HAD) superfamily of hydrolases and for a long time the function of the N-terminal domain was unclear. In our working group, we were able to show for the first time that the mammalian sEH is a bifunctional enzyme as, in addition to the well known enzymatic activity in the C-terminal domain, it possess another active site in its N-terminal domain, with a Mg2+ -dependent phosphatase activity. Based on the homology with other HAD enzymes a two-step mechanism for the newly discovered sEH N-terminal phosphatase has been proposed.rnTo enlighten the catalytic mechanism of dephosphorylation, a biochemical analysis of the human sEH phosphatase catalytic process was performed by constructing active site mutants by site directed mutagenesis. Thus, identifying the active site amino acids that take part in the catalytic process and investigating their role in the catalytic mechanism.rnrnOn the basis of structural and possible functional similarities between the sEH and other members of the HAD superfamily, candidate catalytic amino acids (conserved and partly conserved amino acids) in the active site of the sEH phosphatase domain were predicted to be crucial to its catalytic activity. rnThus, of the amino acids in the phosphatase domain, eight amino acids (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)) were selected to be exchanged to nonfunctional amino acids by site-directed mutagenesis. At least two alternative amino acids, either alanine or an amino acid structurally similar to the one in the wild type enzyme (WT) were introduced for each amino acid candidate. In total, 18 different recombinant clones were constructed encoding mutant sEH phosphatase proteins with a single amino acid residue substitution. The 18 mutants and the WT (N-terminal domain sequence without mutation), constructed in an expression vector, were cloned, verified by restriction and sequencing and recombinantly expressed in E.coli. The constructed mutants and the WT proteins (the soluble 25kD subunit) were successfully purified on metal affinity chromatography and tested for phosphatase activity towards the generic phosphatase substrate 4-nitrophenyl phosphate. Mutants that exhibited any degree of activity were subjected to kinetic assays. From the processed results of the kinetic assays, kinetic parameters were calculated in four well- established calculating methods and interpretation was made according to one method the direct linear plot. rnMost of the 18 mutant proteins were inactive or lost a major part of the enzyme´s activity (Vmax) in comparison to the WT enzyme (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Loss of activity was unlikely to be due to a loss of structural integrity in any of the mutants (as the WT and the mutated proteins had kept the same behaviour upon chromatography). All replacements of residues Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D189) and Asn189 (N189) resulted in a complete loss of phosphatase activity proving their vital function in catalysis. Part of the amino acid exchanges performed for Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) and Asp185 (D185) resulted in mutant proteins that lost a substantial part of their activity but still exhibited detectable activity to different extend (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Mutant proteins of this group showed altered kinetic properties (only in Vmax or Vmax and Km). The analysis of the mutant Asp11 → Asn kinetic result was of special interest, showing a sole combination of a strong reduction in Vmax (8.1 nmol-1 mg-1 min) and a significant reduction in Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), implying a role for the Asp11 (D11) in hydrolysis, the second step of the catalytic cycle. rnAltogether, the results indicate that all examined amino acids are required for the enzyme´s catalytic activity and participate in forming the sEH phosphatase active site. Moreover, with these results we were able to add information to the possible roles of the examined amino acids supporting a two-step catalytic mechanism of dephosphorylation. We can therefore propose a combined reaction mechanism which is related to other members of the HAD family. This mechanism was based on the elucidated 3D structure, the results of this work and results of further biochemical investigations.rnThe two-step catalytic mechanism of dephosphorylation involves a nucleophilic attack of the substrate phosphorous by the active site nucleophile Asp9 (D9) under formation of an acylphosphate enzyme intermediate followed by release of the dephosphorylated substrate. In the second step, hydrolysis of the enzyme phosphate intermediate supported by Asp11 (D11), and release of the phosphate group take place. The other examined amino acids are involved in binding of Mg2+ and/or substrate.rnAs the catalytic mechanism has been elucidated with the contribution of this work, other themes, which are left to be investigated were discussed in this work: the physiological role of the sEH phosphatase, its endogenous-physiological substrates and the way it functions as a bifunctional enzyme (the way the two catalytic sites communicate and on what level).rn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4773
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-27569
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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