Authors:	Schneider, Elke
Title:	Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms
Online publication date:	12-Dec-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU- Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK- Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn Metastatic spread rather than the primary tumor is responsible for the poor prognosis of renal cell carcinomas (RCC). Although the mechanisms of metastasis are well known the organ-selective nature of tumor cells is poorly understood.Approximately 30% of RCC patients develop bone metastases during the course of disease. This high frequency indicates a renal tumor cell favourable environment in the bone matrix supporting metastasis. Characteristic for bone tissue is a unique high concentration of calcium ions. These in combination with the calcium-sensing receptor (CaSR) could partly be implicated in the promotion of bone metastasis. The purpose of this thesis was to reveal the mechanisms which support RCC bone metastasis.rnrnThe initial investigation concerns the signal molecule expression patterns and metastatic behavior of tissue specimens and primary tumor cells collected from RCC patients with differing metastasic sites. Western blot analysis showed characteristic expression patterns which were already existent in the primary tumor and independent of extracellular calcium. This was accompanied by a specific cellular behavior which may or may not promote metastasis in a specific site. RCC tissue specimens and cells from patients who developed bone metastases within five years after nephrectomy, exhibited a high expression of integrin α5, reduction of PTEN expression and intensified activity of Akt and FAK. These alterations facilitated cell migration (analysed chemotactically in a Boyden chamber) in the direction of fibronectin and adhesion to components of the bone extracellular matrix (fibronectin and collagen type I which are both contained in the bone matrix). Migration and adhesion are essential steps during the escape of the RCC cells from the primary tumor and infiltration of the bone matrix. This was not observed in RCC cells from patients with no metastases or those who had developed lung metastases. Thus, certain primary tumors are predestined to form bone metastases.rnrnTo clarify the role of extracellular calcium and CaSR, the expression of CaSR was measured by real-time PCR, Western blot analysis and flow cytometry in RCC tissue specimens and primary cells from patients who did not develop metastases, or those who developed lung or bone metastases within five years after nephrectomy. Specimens from patients developing bone metastases showed the highest expression of CaSR mRNA and CaSR protein compared to patients without or with lung metastases. Treatment of the RCC cells with calcium in physiological concentrations had no influence on the expression of CaSR, therefore it can not be seen as a regulator for the expression of CaSR. The impact of calcium on the ability of RCC cells to metastasize was analyzed chemotactically in a Boyden cell migration assay with calcium as a chemotaxin. Cell proliferation was measured by BrdU incorporation after treatment of the cells with calcium. Elevated extracellular calcium promoted migration and proliferation (in a concentration dependent manner) of RCC cells from patients with bone metastases but not of cells from patients who had no metastases or developed lung metastases. These are further essential steps during infiltration of the bone matrix and formation of metastases. The contributing signal transduction molecules were investigated by further Western blot analyses and a phospho-kinase array. Calcium treatment induced an increase in the activity of Akt, JNK, p38α and PLCγ-1 and an almost complete decline in the expression of PTEN in RCC cells from patients developing bone metastases. The importance of the CaSR in formation of bone metastases was verified by its selective blocking using the CaSR inhibitor NPS 2143.rnrnRCC cells from patients with bone metastases are characterized by a specific expression pattern of various signaling mediators, defining their metastatic potential and location. In disseminated CaSR expressing RCC cells which reach the calcium enriched bone environment through blodd circulation, these metastatic abilities are further enhanced by calcium and finally cause the formation of bone metastases. Therefore the CaSR should be regarded as a new prognostic marker predicting RCC bone metastasis. The selection of adjuvant therapeutics and follow-up examinations should be adapted to the characteristics of the primary tumor to achieve an individualized therapy.rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4746
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-32994
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	189 S.
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