Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4713
Authors: Tresch, Stefan
Title: Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds
Online publication date: 8-Nov-2012
Language: english
Abstract: Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.
Biologisch aktive Moleküle zur Modulierung von Prozessen in Pflanzen werden eingesetzt in der landwirtschaftlichen Praxis, als Herbizide oder Wachstumsregulatoren und in der pflanzenphysiologischen Grundlagenforschung. Viele der aktiven Wirkstoffe wurden in Wirkstoff-Screens der Pflanzenschutzindustrie identifiziert. Neue phytoaktive Wirkstoffe wurden zusätzlich in Screening-Kampagnen der akademischen Forschung identifiziert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es verschiedene Methodenansätze zur Wirkortaufklärung von phytoaktiven Wirkstoffen zu vergleichen, um das primäre Targetprotein eines phytoaktiven Wirkstoffs zu identifizieren. Dabei können die Methodenansätze in drei Typen unterteilt, einen Phänotyp-Ansatz, einen Ansatz der auf einem Resistenzscreen basiert und einen biochemischen Screening-Ansatz. Vier meiner eigenen Publikationen werden beispielhaft für den Phänotyp-Ansatz präsentiert. I. Eine Untergruppe von Cyanoacrylaten wurden als herbizid aktive Wirkstoffe identifiziert. In einem Set von Bioassays wurde deren primärer Einfluss auf die Zellteilung erkannt. Nachfolgende zytologische Studien zeigten einen Effekt von Cyanoacrylaten auf das Mikrotubuli-Assembly. Der Vergleich der Sensitivität einer Dinitroanilin resistenten und empfänglichen Eleusine indica Aufsammlung konnte zeigen, dass Eleusine indica Pflanzen mit einer Mutation im alpha-Tubulin die Dinitroanilin-Resistenz verursacht, auch resistent gegenüber Cyanoacrylaten sind. Die Bindungsstelle ist damit identisch mit Dinitroanilinen (Tresch et al., 2005). II. Der Wirkmechanismus von Flamprop-M-Methyl war bisher nicht bekannt und publizierte Studien weisen auf einen primären Effekt auf die Zellteilung hin (Tresch et al., 2008). Zellbiologische Studien identifizierten einen spezifischen Effekt auf die Ausbildung der Mitose-Spindel. Im Gegensatz zu anderen Inhibitoren des Tubulin-Assembly, wie z. B. Dinitroaniline, beeinflusst Flamprop-M-Methyl nicht das Mikrotubuli-Assembly in vitro. Anhand der Studien konnte abgeleitet werden, dass Flamprop-M-Methyl möglicherweise die Zytoskelett-Regulation beeinflusst. (Tresch et al., 2008). III. Endothall ist ein Herbizid mit Strukturähnlichkeit zum Naturstoff Cantharidin, einem Proteinphosphatase Hemmstoff. Biotests wiesen auf einen dominanten Effekt von Endothall auf die Proliferation von heterotrophen Zellkulturen hin der unabhängig von der Wirkung im Licht ist. Zellbiologische Studien zur Untersuchung des Mikrotubuli-Zytoskelett in Wurzelspitzen von Mais und heterotrophen Tabakzellen einer Suspensionskultur zeigten spezifische Effekte auf die Mitosespindel und die Ultrastruktur der Zellkerne bei gleichzeitigem Einfluss aus die Zellproliferationsrate. Die Effekte sind ähnlich zu anderen Proteinphosphatase Hemmstoffen wie Cantharidin. Zudem wiesen die beobachteten Effekte starke Ähnlichkeit zu knock-out Mutanten in der TON1 Signaltransduktion hin, einem Proteinphosphatase reguliertem Signalweg. Die Daten aus Tresch et al. (2011) zeigen klar die Beziehung der Endothall-Effekte mit der Beeinflussung des TON1 Signaltransduktionsweges. IV. Mefluidide, ein Wachstumsregulator induziert eine Wachstumsretardierung und einen Phänotyp der eine Hemmung der Fettsäurebiosynthese nahelegt. Der Test der Kutikula-Funktionalität weist auf einen Defekt der Biosynthese sehr langkettiger Fettsäuren (VLFCA) oder Wachsen hin. Metabolite-Profiling Studien zeigten Ähnlichkeiten von Mefluidide zu verschiedene Gruppen von VLCFA Synthese Hemmstoffen. Detailliertere Studien zur VLCFA Zusammensetzung in Lemna paucicostata wiesen auf eine spezifische Hemmung der 3 Ketoacyl-CoA Synthasen (KCS) hin. Studien mit einem Hefeexpressionssystem zur rekombinanten Expression von pflanzlichen KCS bestätigten die Hemmwirkung von Mefluidide auf pflanzliche KCS Enzyme. Das Arabidopsis Cer6 Protein ist das sensitivste Isoenzym der 7 untersuchten KCS Enzyme (Tresch et al., 2012). Die Ergebnisse meiner Arbeiten wurden zusammen mit literaturbekannten Studien zum Wirkungsmechanismus phytoaktiver Wirkstoffe ausgewertet. Auf Basis dieser Auswertung wurde ein 3-Ebenen Modell entworfen zur zielgerichteten Wirkmechanismus-Aufklärung. In der ersten Ebene werden Fragestellungen wie metabolische Stabilität, Effekte in verschiedenen Spezies, generelle Zytotox und Effekte auf Transkription & Translation adressiert. Basierend auf diesen Studien kann dann in der 2. Ebene der Wirkmechanismus-Charakterisierung die Entscheidung getroffen werden ob der Phänotyp-Ansatz erfolgreich weitergeführt werden kann oder mit einem Resistenz-Screen oder einem Biochemie-Screen begonnen werden kann. In der 3. Ebene werden Target-Hypothesen aus den durchgeführten Studien im Enzym-Aktivitäts-Assay oder in Komplementationsstudien überprüft, um die in vivo Aktivität mit der in vitro Aktivität der Wirkstoffs zu verbinden.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4713
URN: urn:nbn:de:hebis:77-32599
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 103 S.
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