Authors:	Suarez Fernandez, Maria Luisa
Title:	Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung
Online publication date:	8-Oct-2012
Year of first publication:	2012
Language:	german
Abstract:	Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn The Apicomplexa are a large group of unicellular organisms, most of which are obligatory intracellular parasites. Well-known and highly infective human parasites like Plasmodium sp. and also animal parasites like Eimeria sp. and Theileria sp. belong to this group. Eimeria sp. causes the poultry disease coccidiosis, which is responsible for enormous economic losses of about 3 billion US$ per year [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. The rapid increase of drug resistance against therapeutic agents, as well as the expensive vaccination due to a low reproductive index of currently available vaccine strains, requires the development of new effective treatments towards coccidiosis [KINNAIRD et al., 2004]. rnCyclin-dependent-kinases (CDKs) are validated drug-targets, due to their key regulatory function in eukaryotic cell cycle [LEHNINGER et al., 2005]. Using the well-known CDK- inhibitor flavopiridol the CDC2-related kinase 2 of Eimeria tenella (EtCRK2) was chemical validated as a promising drug-target [ENGELS et al., 2010]. As well as for other CDKs, the activity of EtCRK2 depends on the binding of an activator, which also belongs to the cyclin-protein family. This natural EtCRK2-activator was so far unknown. Therefore, one goal of this work was the identification of the natural EtCRK2-activator. Bioinformatics analysis revealed four E. tenella cyclin-like-proteins (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), which were closely related to Plasmodium falciparum-cyclins [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., 2012]. Two new activators were identified and biochemical characterized in complex with EtCRK2: the well-known CDK-activator XlRINGO (Xenopus laevis rapid inducer of G2/M progression in oocytes) and the novel E. tenella-cyclin EtCYC3a. The activity of EtCRK2 in complex with both activators and further kinetic parameters were determined using the non-radioactive TR-FRET-assay, which was established and optimized for EtCRK2.rnMoreover, the TR-FRET-assay was used for in vitro high-throughput screening of a commercial chemical library using EtCRK2 as the protein target, in order to find potential inhibitors. 19 active compounds were identified for EtCRK2 in complex with EtCYC3a and XlRINGO followed by an in silico hit-enrichment. As a result, three structural clusters were built for the active compounds: naphthoquinone-, the 8-hydroxyquinoline- and the 2-pyrimidinyl-aminopiperdine-propan-2-ol-cluster. The most active compounds of each cluster were selected as lead-structures and were tested on EtCRK2 and HsCDK2. Because of their high activity against EtCRK2 these compounds represent promising lead-structures for the development of novel anticoccidial drugs.rn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4687
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-32268
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	124 S.
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