Authors:	Christ, Justyna Barbara
Title:	Untersuchung neuer hochwirksamer neuroprotektiver Antioxidantien in experimentellen Modellen der Parkinsonschen Krankheit
Online publication date:	22-Jun-2010
Year of first publication:	2010
Language:	german
Abstract:	Bei der Parkinsonschen Krankheit kommt es zu einer selektiven Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Pathogenese dieser Erkrankung konnte an post mortem Untersuchungen der Parkinson-Patienten, wie auch an zahlreichen in vitro und in vivo Modellen bestätigt werden. Die Anwendung von Antioxidantien wurde als therapeutische Strategie der Parkinsonschen Krankheit vorgeschlagen. In dieser Hinsicht wurden bereits antioxidative Substanzen in klinischen Studien evaluiert. Klinische Studien mit Antioxidantien haben jedoch bislang nur wenig überzeugende Ergebnisse erbracht, mit Ausnahme des Einsatzes des Ubichinons (Coenzym Q). Eine kritische Analyse der klinischen Studien lässt zusammenfassen, dass auf Seiten der verwendeten Antioxidantien noch massiver Optimierungsbedarf besteht. Für einen erfolgreichen therapeutischen Einsatz von Antioxidantien bei dieser Krankheit sind folgende Eigenschaften der Substanzen von höchster Bedeutung: i) maximale neuroprotektive Aktivität bei geringen Dosen; ii) geringe Nebenwirkungen; iii) eine hohe Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.In dieser Arbeit wurde das neuroprotektive Potential von drei Bisarylimin-basierten antioxidativen Strukturen (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) in in vitro und in vivo Parkinson-Modellsystemen evaluiert. Beide experimentellen Modelle basieren auf der Wirkung der mitochondrialen Komplex I Inhibitoren 1-Methyl-4-Phenylpyridin (MPP+) und Rotenon, welche pathophysiologische Charakteristika der Parkinsonschen Krankheit reproduzieren. Unsere in vitro Untersuchungen an primären Neuronen des Mittelhirns und der klonalen SH-SY5Y-Neuroblastomazelllinie konnten zeigen, dass die Komplex I Inhibition krankheitsspezifische zelluläre Merkmale induziert, wie die Abnahme der antioxidativen Verteidigungskapazität und Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Zusätzlich kommt es in primären Neuronen des Mittelhirns zur selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, welche in der Parkinsonschen Erkrankung besonders betroffen sind. Ko-Inkubation der in vitro Modelle mit Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (50 nM) halten die pathologischen Prozesse fast vollständig auf. In vivo Untersuchungen am MPP+- und Rotenon-basierten Caenorhabditis elegans (C. elegans) Modell bestätigen das neuroprotektive Potential der Bisarylimine. Hierfür wurde eine transgene C. elegans Linie mithilfe einer dopaminerg spezifischen DsRed2- (Variante des rot fluoreszierenden Proteins von Discosoma sp.)-Expression und pan-neuronaler CFP- (cyan fluoreszierendes Protein)-Expression zur Visualisierung der dopaminergen Neuronenpopulation in Kontrast zum Gesamtnervensystem erstellt. Behandlung des C. elegans mit MPP+ und Rotenon im larvalen und adulten Stadium führt zu einer selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, sowie zum Entwicklungsarrest der larvalen Population. Die dopaminerge Neurodegeneration, wie auch weitere phänotypische Merkmale des C. elegans Modells, können durch Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (500 nM) komplett verhindert werden. Ein systemischer Vergleich aromatischer Bisarylimine mit bekannten, gut charakterisierten Antioxidantien, wie α-Tocopherol (Vitamin E), Epigallocatechingallat und β-Catechin, zeigt, dass effektive Konzentrationen für Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin um Zehnerpotenzen niedriger liegen im Vergleich zu natürlichen Antioxidantien. Der Wirkungsmechanismus der Bisarylimine konnte in biochemischen und in vitro Analysen, sowie in Verhaltensuntersuchungen an C. elegans von der Wirkungsweise strukturell ähnlicher, neuroleptisch wirkender Phenothiazin-Derivate differenziert werden. Die Analyse des dopaminerg-gesteuerten Verhaltens (Beweglichkeit) in C. elegans konnte verdeutlichen, dass antioxidative und Dopaminrezeptor-bindende Eigenschaften der Bisaryliminstrukturen sich gegenseitig ausschließen. Diese qualitativen Merkmale unterscheiden Bisarylimine fundamental von klinisch angewandten Neuroleptika (Phenothiazin-Derivate), welche als Dopaminrezeptor-Antagonisten zur Behandlung psychischer Erkrankungen klinisch eingesetzt werden.Aromatische Bisarylimine (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) besitzen günstige strukturelle Eigenschaften zur antioxidativ-basierter Neuroprotektion. Durch die Anwesenheit der antioxidativ wirkenden, nicht-substituierten Iminogruppe unterscheiden sich Bisarylimine grundlegend von neuroleptisch-wirkenden Phenothiazin-Derivaten. Wichtige strukturelle Voraussetzungen eines erfolgreichen antioxidativen Neuropharmakons, wie eine hohe Radikalisierbarkeit, die stabile Radikalform und der lipophile Charakter des aromatischen Ringsystems, werden in der Bisaryliminstruktur erfüllt. Antioxidative Bisarylimine könnten in der Therapie der Parkinsonschen Krankheit als eine effektive neuroprotektiv-therapeutische Strategie weiter entwickelt werden. Parkinsons disease is characterized by a selective degeneration of dopaminergic neurons in the Substantia nigra pars compacta. Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of Parkinsons disease as shown in post mortem analysis on Parkinsons patients and in numerous in vitro and in vivo investigations. Therefore, antioxidants were proposed as therapeutic strategy for Parkinsons disease. The evaluation of antioxidants in clinical trials did not show any conclusive effects so far, except the application of ubiquinone (coenzyme Q). A critical analysis of clinical trials suggests a demand of optimization at the side of the antioxidants used. For a successful therapeutic application of antioxidants in this disorder the following properties are of highest importance: i) maximal neuroprotective activity at low dosis; ii) minimal side effects; iii) good blood-brain-barrier permeability. In this work the neuroprotective potential of three bisarylimine-based antioxidant structures (phenothiazine, iminostilbene and phenoxazine) was evaluated in in vitro and in vivo models of Parkinsons disease. Both experimental models are based on the effects of the mitochondrial complex I inhibitors 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+) and rotenone, which reproduce pathophysiological characteristics of Parkinsons disease. Our investigations on primary midbrain neurons and on the clonal SH-SY5Y neuroblastoma cell-line showed, that complex I inhibitors induce disease-associated cellular characteristics, like reduction of antioxidant defence capacity and loss of mitochondrial membrane potential. Additionally, a selective loss of dopaminergic neurons was observed in primary midbrain neurons, which are particularly affected in Parkinsons disease. Co-incubations of in vitro models with phenothiazine, iminostilbene and phenoxazine at low concentrations (50 nM) almost completely impede these pathological processes. In vivo analysis on MPP+- and rotenone-based Caenorhabditis elegans (C. elegans) models affirm the neuroprotective potential of bisarylimines. For this purpose a transgenic C. elegans line with a dopaminergic specific DsRed2- (variant of red fluorescent protein of Discosoma sp.)-expression and pan-neuronal CFP- (cyan fluorescent protein)-expression was generated to visualize dopaminergic neurons in contrast to the whole nerve system. Treatment of C. elegans with MPP+ or rotenone in larval or adult stages led to a selective degeneration of dopaminergic neurons, as well as to developmental arrest of the larval population. The dopaminergic neurodegeneration and other phenotypical characteristics of C. elegans models are prevented with phenothiazine, iminostilbene and phenoxazine at low concentrations (500 nM). A systemic comparison of aromatic bisarylimines with known, well characterized antioxidants, like α-tocopherol (vitamine E), epigallocatechine-gallate or β-catechine showed that effective concentrations of phenothiazine, iminostilbene and phenoxazine are ten-times lower as compared to natural antioxidants. In biochemical and cellular analysis, as well as in behavioural studies on C. elegans, the mode of action of bisarylimines was differentiated from qualities of phenothiazine-derivatives with neuroleptic activity. Analysis of the dopamine-controlled behaviour in C. elegans could clarify, that antioxidant and dopamine receptor binding properties of bisarylimines and neuroleptics are exclusive. These qualitative properties distinguish bisarylimines fundamentally from neuroleptics (phenothiazine-derivatives), which are clinically employed as dopamine receptor antagonists for treatment of mental disorders. Aromatic bisarylimines (phenothiazine, iminostilbene and phenoxazine) display advantageous attributes for antioxidant-based neuroprotection. Important structural prerequisites of successful antioxidant neuropharmaceutics, like high radicalisation ability, stable radical form of the aromatic ring system and lipophilic property, required for blood-brain-barrier permeability, are achieved in the bisarylimine structure. The presence of the antioxidant operating, non-substituted iminogroup fundamentally differ bisarylimines from neuroleptically acting phenothiazine-derivatives. Antioxidant bisarylimines could be further developed in the therapy of Parkinsons disease as effective neuroprotective-therapeutic strategy.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4623
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-23038
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	178 S.
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