Authors:	Frick, Stefanie Ulrike
Title:	Surface-­functionalized nanomaterials for a drug-delivery system in cancer immunotherapy
Online publication date:	19-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	In cancer therapy there is a vast demand on novel cell type-specific drug delivery systems. High tunable engineered nanomaterials bear many characteristics that make them attractive as a drug carrier for improved immunotherapy. This thesis aims to disclose the biological interaction with as well as the uptake by primary human immune cells of chemically modified polystyrene nanoparticles and biologically functionalized hydroxyethyl starch nanocapsules. In a first approach, polystyrene nanoparticles were studied as a model system for investigating the influence of chemical surface modifications on the uptake of nanoparticles by human dendritic cells and their immunogenicity. Fluorescently labeled sulfonate- and phosphonate-functionalized polystyrene nanoparticles were found to be taken up by human monocyte-derived immature and mature dendritic cells as measured by flow cytometry. Confocal laser scanning microscopy ascertained the intracellular nanoparticle uptake. The nanoparticle influence on dendritic cell maturation was addressed by the use of human immature monocyte-derived dendritic cells that can differentiate into mature dendritic cells upon activation. Both nanoparticles induced enhanced maturation of immature dendritic cells as depicted by upregulation of dendritic cell maturation markers as well as co-stimulatory molecules accompanied with elevated amounts of cytokines associated with dendritic cell activation compared to untreated dendritic cells. Sulfonate- as well as phosphonate-functionalized nanoparticles increased the T cell stimulatory potential of immature dendritic cells indicating a T helper type 1 cell response. In a second approach, biodegradable hydroxyethyl starch nanocapsules were surface-functionalized with the cytokine IL-2 and their interaction with and uptake by IL-2 receptor-bearing T cells was assessed. The biological functionality of IL-2 linked to the capsule surface was confirmed on IL-2-dependent growing murine CTLL-2 cells. In order to investigate the uptake of IL-2-functionalized nanocapsules, primary human CD4+ T cells were isolated from peripheral blood and activated for increased CD25 expression, which represents the IL-2 receptor alpha subunit and is decisive for internalization of the high affinity IL-2 receptor. IL-2-functionalized hydroxyethyl starch nanocapsules showed a significant uptake by CD4+CD25high T cells compared to control capsules. Along capsule uptake IL-2-induced proliferation of CD4+CD25high T cells was assessed with a proliferation dye by flow cytometry. In order to analyze the impact of different amounts of IL-2 linked to the nanocapsules, hydroxyethyl starch nanocapsules were surface-functionalized with half the amount of IL-2. Reduced amounts of IL-2 resulted in diminished CD4+CD25high T cell proliferation and impaired uptake efficiency by CD4+CD25high T cells. Moreover, IL-2-functionalized hydroxyethyl starch nanocapsules were intravenously injected in mice and their biodistribution in spleen, liver and lymph nodes was measured. Elevated levels of nanocapsule-positive CD4+CD25+ T cells isolated from the lymph nodes were detected compared to control mice. In summary, in this study polystyrene nanoparticles were analyzed for their chemical surface modification, whereas hydroxyethyl starch nanocapsules were even ligand-functionalized for a cell type-specific uptake. Studying IL-2-functionalized hydroxyethyl starch nanocapsules revealed a cell type-specific uptake by CD4+CD25high T cells. This study provides substantial findings for the future development of IL-2-functionalized nanocapsules as a drug delivery system for CD4+CD25high T cells in cancer immunotherapy. Zell-spezifische Tumortherapien für eine gezielte Verabreichung von Therapeutika rücken immer mehr in den Fokus intensiver Forschung. Dabei sind Polymer-basierte Nanopartikel, deren physikochemischen Eigenschaften leicht modifiziert werden können, von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktion und die Aufnahme chemisch modifizierter Polystyrolpartikel und biologisch funktionalisierter Hydroxyethylstärkekapseln analysiert. In einem ersten Ansatz wurden Polystyrolpartikel als Modellsystem genutzt, um den Einfluss chemischer Oberflächenmodifikationen auf die Aufnahme in humane dendritische Zellen und deren immunmodulatorischen Eigenschaften zu untersuchen. Anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen konnte die Aufnahme fluoreszenzmarkierter Sulfonat- und Phosphonat-funktionalisierter Polystyrolpartikel in humane dendritische Zellen gezeigt werden. Die intrazelluläre Aufnahme wurde mit Hilfe konfokaler Mikroskopie bestätigt. Unreife dendritische Zellen differenzieren durch Aktivierung zu reifen dendritischen Zellen. Ausgehend davon wurde der Einfluss der Nanopartikel auf die Reifung humaner dendritischer Zellen mittels Durchflusszytometrie erforscht. Sowohl Sulfonat- als auch Phosphonat-funktionalisierte Polystyrolpartikel induzierten eine Reifung unreifer dendritischer Zellen, die anhand einer erhöhten Expression von Oberflächenmolekülen, welche bei der Reifung und Stimulation dendritischer Zellen beteiligt sind, gemessen wurde. Außerdem zeigte sich in einer Kokultur mit allogenetischen T-Zellen, dass beide chemisch modifizierten Polystyrolpartikel eine erhöhte T-Zell-Stimulierung durch Nanopartikel-beladene dendritische Zellen hervorrufen, die auf eine Th1-Aktivierung hinweist. In einem zweiten Ansatz wurde auf die Interaktion und die Aufnahme von bioabbaubaren Hydroxyethylstärkekapseln, die mit dem Zytokin IL-2 funktionalisiert wurden, durch IL-2-Rezeptor-tragende T-Zellen fokussiert. Die biologische Aktivität der IL-2-Kapseln wurde durch die Proliferation IL-2-abhängiger CTLL-2-Zellen bestätigt. Aufnahmestudien wurden mit primären humanen CD4+-T-Zellen durchgeführt, die zuvor für eine erhöhte CD25-Expression aktiviert wurden. CD25 bildet die alpha-Untereinheit des IL-2-Rezeptors und ist für die Bildung des hochaffinen IL-2-Rezeptors essentiell. IL-2-funktionalisierte Hydroxyethylstärkekapseln zeigten eine signifikant erhöhte Aufnahme durch CD4+CD25high-T-Zellen im Vergleich zu nicht funktionalisierten Hydroxyethylstärkekapseln. Neben der Aufnahme wurde mittels Durchflusszytometrie eine verstärke Proliferation von CD4+CD25high-T-Zellen durch IL-2-funktionalisierte Stärkekapseln gemessen. Um die Wirkung unterschiedlicher Mengen des gebundenen IL-2 auf der Kapseloberfläche zu analysieren, wurden weitere Hydroxyethylstärkekapseln, die mit der halben Menge an IL-2 auf der Oberfläche funktionalisiert wurden, untersucht und miteinander verglichen. Geringere Mengen an IL-2 auf der Kapseloberfläche deuteten eine reduzierte Aufnahme der Kapseln durch CD4+CD25high-T-Zellen an. IL-2-funktionalisierte Kapseln wurden weiterhin intravenös in Mäuse injiziert, um deren Verteilung in Milz, Leber und Lymphknoten zu untersuchen. Aus den Lymphknoten isolierte CD4+CD25+-T-Zellen zeigten eine verstärkte Assoziation mit IL-2-funktionalisierten Hydroxyethylstärkekapseln. Insgesamt wurde in der vorliegenden Arbeit die Aufnahme in sowie die immunmodulatorischen Eigenschaften von Sulfonat- und Phosphonat-modifizierten Polystyrolpartikeln auf humane dendritische Zellen untersucht. Im Gegensatz zu den Polystyrolpartikeln wurden die Hydroxyethylstärkekapseln direkt mit einem biologischen Liganden für eine zell-spezifische Aufnahme modifiziert. Untersuchungen der IL-2-funktionalisierten Kapseln zeigten eine zell-spezifische Aufnahme und T-Zellproliferation. Diese Untersuchung trägt substantiell zur Weiterentwicklung von IL-2-funktionalisierten Kapseln für die gezielte Verabreichung von Therapeutika in CD4+CD25+-T-Zellen bei.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4596
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008934
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	120 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen