Authors:	Mattheus, Tobias
Title:	Characterization of cell type-specific endocannabinoid signaling at biochemical level
Online publication date:	19-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	The cannabinoid receptor type 1 (CB1) is one of the most abundant G protein-coupled receptors (GPCRs) in the brain and mediates a wide range of behavioral and physiological responses. It is differentially expressed in various neuronal subtypes and moreover, exerts distinct signaling in the respective cell types. Whereas its physiological functions have been well studied, the highly complex intracellular signaling at the molecular level, which leads to differential CB1 signaling, has not been well understood. The present study aimed at the purification of cell type-specific CB1 protein complexes and identification of CB1-interacting proteins. By combining adeno-associated virus (AAV)-mediated transgene transfer, conditionally Cre-recombinase expressing mouse lines, and tandem affinity purification (TAP) of hippocampal synaptosome preparations, an experimental set up was established, which allowed the purification of CB1 multiprotein complexes in mouse hippocampal glutamatergic neurons and GABAergic interneurons under native conditions. The composition of these protein complexes was then revealed by deep-coverage mass spectrometry (MS). In the MS approach, 951 proteins were identified in the TAP samples of glutamatergic and GABAergic CB1 protein complexes, with 41 being specific for glutamatergic neurons and 83 specific for GABAergic interneurons. The high number of co-purified proteins suggests that not only directly interacting proteins were purified, but higher order structures including cytoskeletal elements and scaffolding proteins. The whole dataset of purified proteins reflects known functions of CB1 and depicts the complex biosynthesis and trafficking of this membrane receptor, which acts in different subcellular compartments. Together with a number of identified already known CB1-interacting proteins, the dataset can be judged as coherent and meaningful, with a plethora of yet unknown distinctly interesting potential interactors. A number of cell type-specific co-purified proteins may hold the potential to contribute to differential signaling in the respective hippocampal neuronal subtype, but further functional studies need to be performed to reveal the functional relevance of interesting target proteins. Thus, an extensive basis for new hypotheses and further studies on differential CB1 signaling was generated. To further test a yet unknown identified potential interactor of CB1, functional studies on G protein subunit alpha z (Gαz) were carried out. CB1 and Gαz are coexpressed in glutamatergic principal cells as well as GABAergic interneurons in the hippocampus of wildtype mice. A functional interaction of Gαz after activation of CB1 could be shown in an in vitro model using stably CB1 expressing HEK293 cells with transiently overexpressed inhibitory G proteins Gαz or Gαo. A kinetic assay to measure cyclic adenosine monophosphate (cAMP) turnover upon adenylyl cyclase (AC) stimulation with forskolin showed a CB1-mediated inhibition of cAMP synthesis upon CB1 agonist treatment of the cells. An additional treatment with pertussis toxin (PTX) led to an inhibition of cAMP synthesis only in the Gαz, but not in the Gαo overexpressing cells, since Gαz is the only PTX-insensitive inhibitory G protein. Thus, a functional interaction with one identified candidate interactor of CB1 could be verified. Der Cannabinoidrezeptor Typ 1 (CB1) ist einer der häufigsten Rezeptoren im Gehirn und vermittelt ein breites Spektrum an Verhaltens- und physiologischen Reaktionen. Er ist in verschiedenen Neuronentypen unterschiedlich stark exprimiert und zeigt darüber hinaus unterschiedlich ausgeprägte Signalübertragungseigenschaften in den jeweiligen Zelltypen. Seine Rolle in der Regulation physiologischer Funktionen ist gut untersucht, wohingegen die hochkomplexe intrazelluläre Signalübertragung auf molekularer Ebene, die Grundlage seines differenziellen Signalverhaltens, noch nicht gut erforscht ist. Die vorliegende Arbeit zielte auf eine Aufreinigung von zelltyp-spezifischen CB1 Proteinkomplexen und anschließender Identifikation CB1-interagierender Proteine ab. Mit einer Kombination aus adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermitteltem Transgentransfer, konditional Cre Rekombinase-exprimierenden Mauslinien und Tandem Affinity Purification (TAP) von hippocampalen Synaptosomenpräparationen wurde ein Experimentalaufbau geschaffen, der eine Isolation von CB1 Multiproteinkomplexen aus hippocampalen glutamatergen Neuronen und GABAergen Interneuronen von Mäusen unter nativen Bedingungen ermöglicht. Die Zusammensetzung dieser Proteinkomplexe wurde daraufhin mittels hochsensitiver Massenspektrometrie (MS) entschlüsselt. Mittels dieses experimentellen Ansatzes konnten 951 Proteine in den TAP Proben glutamaterger und GABAerger CB1 Proteinkomplexe identifiziert werden, von denen 41 spezifisch für glutamaterge Neurone und 83 spezifisch für GABAerge Interneurone sind. Die hohe Zahl identifizierter Proteine deutet auf eine Aufreinigung nicht nur direkt CB1-interagierender Proteine hin, sondern Strukturen höherer Ordnung, inklusive Zytoskelettproteinen und Strukturproteinen. Der gesamte Datensatz aufgereinigter Proteine reflektiert bekannte Funktionen von CB1 und stellt die komplexe Biosynthese und den Transport dieses Membranrezeptors in verschiedenen subzellulären Bereichen dar. Zusammen mit der Identifikation einiger bereits bekannter CB1-interagierender Proteine kann der Datensatz als kohärent und aussagekräftig betrachtet werden, mit einer Vielzahl bisher unbekannter, potentiell interessanter Interaktoren. Eine Anzahl von zelltyp-spezifisch gereinigten Proteinen könnte das Potential haben zum differentiellen Signalverhalten in den jeweiligen Neuronentypen beizutragen, jedoch müssen weitere funktionelle Studien durchgeführt werden, um die funktionelle Bedeutung interessanter Proteine zu entschlüsseln. Somit wurde eine umfangreiche Basis für neue Hypothesen und weitere Studien für differentielle CB1 Signalübertragung generiert. Um darüber hinaus ein bisher unbekanntes, potentiell mit CB1 interagierendes Protein zu testen, wurden funktionale Studien mit G protein subunit alpha z (Gαz), welches in den TAP Proben identifiziert wurde, durchgeführt. CB1 und Gαz sind in glutamatergen Neuronen und GABAergen Interneuronen im Hippocampus von Wildtyp-Mäusen ko-exprimiert. Eine funktionelle Interaktion von Gαz nach Aktivierung von CB1 konnte in einem in vitro-Modell mit stabil CB1-exprimierenden HEK293 Zellen und transient überexprimierten inhibitorischen G Proteinen Gαo oder Gαz gezeigt werden. Eine kinetische Untersuchung des Umsatzes von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) nach Stimulierung der Adenylatzyklase (AC) mit Forskolin zeigte eine CB1-vermittelte Inhibition der cAMP Synthese nach CB1 Agonist-Behandlung der Zellen. Eine zusätzliche Behandlung mit Pertussistoxin (PTX) führte zu einer Inhibition der cAMP Synthese nur in den Gαz-, jedoch nicht in den Gαo-überexprimierenden Zellen, da Gαz das einzige Pertussistoxin-insensitive inhibitorische G Protein ist. Somit konnte eine funktionelle Interaktion mit einem der identifizierten Interaktionskandidaten von CB1 verifiziert werden.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4595
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008923
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	III, 176 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen