Authors:	Lokan, Stefanie
Title:	Wirkungsweise von Artesunat in Kombination mit Temozolomid und Bestrahlung in Glioblastomzellen
Online publication date:	18-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Die häufigste und aggressivste Form von Hirntumoren bei erwachsenen Menschen sind die Glioblastome (Stufe WHO-IV), bei denen die Rate der Neuerkrankungen weiter zunimmt. Die Tumortherapie bestehend aus Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie führt zu einer mittleren Überlebenszeit von etwa 15 Monaten nach Diagnose. Die geringe Wirkung der Chemo- und Radiotherapie ist zum größten Teil auf die Entwicklung von Resistenzmechanismen zurückzuführen. Deswegen ist eine Steigerung der Effektivität der Chemo- und Radiotherapie dringend erforderlich. Artesunat, ein Anti-Malaria-Wirkstoff, der in vitro die Zellteilung bei Krebszellen hemmt, wurde in der hier vorliegenden Arbeit mit Temozolomid und Bestrahlung kombiniert und analysiert. Ein Grundstein der Arbeit bildete die Fragestellung, ob diese Kombination eine positive Wirkung auf die Effektivität der Tumortherapie hat und falls ja, welche Mechanismen dem zugrunde liegen. Ferner sollte untersucht werden, ob ein in vitro etabliertes Behandlungsschema mit Erfolg auf in vivo Modelle übertragbar ist. Eines der wichtigsten und am häufigsten für Glioblastome verwendeten Chemotherapeutika ist das Temozolomid, das – ebenso wie Bestrahlung – DNA-Schäden induziert. Diese führen bei den Glioblastomzellen zu einem Zellzyklusarrest, Induktion des Zelltods, aber auch zur Induktion von Überlebensmechanismen wie der Autophagie und der Seneszenz. In dieser Studie wurden sowohl Temozolomid als auch die Bestrahlung mit Artesunat in einem neuen Behandlungsansatz kombiniert. Zur Etablierung des in vitro Behandlungsschemas wurden Zelltodanalysen an drei Glioblastomzelllinien für verschiedene applizierte Dosen Artesunat und unterschiedliche Behandlungsdauer sowie verschiedene Therapieabfolgen in Einzel- und Kombinationsbehandlung durchgeführt. Die Kombination mit Artesunat führte zu einer deutlichen Steigerung der Effektivität im Vergleich zu den Einzelbehandlungen. Nach Etablierung der sequentiellen Kombinationsbehandlung stellte sich die Frage nach den zugrunde liegenden Mechanismen. Eine der ersten Hypothesen, basierend auf bereits publizierten Ergebnissen, zielte auf die genotoxische Wirkung aller drei Noxen: Da sowohl Temozolomid, Bestrahlung als auch Artesunat DNA-Schäden induzieren, lag die Vermutung nahe, dass eine Akkumulation von DNA-Schäden zur gesteigerten Toxizität führt. Diese Hypothese konnte durch die Analyse von Proteinen der DNA-Schadensantwort nicht bestätigt werden. Weitere Analysen kombiniert mit Erkenntnissen aus der Literatur führten zu der Hypothese, dass die gesteigerte Toxizität der Kombination auf der Inhibition von Überlebensmechanismen wie Autophagie und Seneszenz basiert, die durch Temozolomid induziert werden und für die Entstehung von Resistenzen verantwortlich sein könnten. Die Untersuchungen bestätigten letztendlich, dass Artesunat auf die durch Temozolomid induzierte Autophagie einwirkt und die die durch Temozolomid induzierte Seneszenz inhibiert. Die Inhibition der Seneszenz führte in dieser Studie zur Erhöhung der Toxizität und somit zur Steigerung der Effektivität der Chemotherapie. Das in vitro etablierte Behandlungsschema wurde erfolgreich auf ein subkutanes und folgend auf ein intrakranielles Tumormodel in der Maus übertragen. Die Steigerung der Effektivität der Kombinationsbehandlung konnte in den beiden Mausmodellen bestätigt werden. Es zeigte sich besonders im intrakraniellen Modell eine 40% längere Lebensdauer der Mäuse mit kombinierter Behandlung von Artesunat und Temozolomid verglichen mit der alleinigen Behandlung mit Temozolomid. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die effiziente Verstärkung der Chemotherapie durch Artesunat an der Inhibition der durch die Behandlung induzierten Überlebensmechanismen der Zellen liegt. Die verbesserten Therapieergebnisse der sequentiellen Behandlung mit Temozolomid und Artesunat bieten somit eine vielversprechende Strategie für zukünftige Krebstherapien, die in klinischen Studien untersucht werden sollte. The most common and aggressive form of brain tumors in adult humans are the glioblastomas (WHO-IV), where the rate of new diseases continues to increase. Tumor therapy, which generelly includes a combination of resection, radiation and chemotherapy, leads to a mean survival time of approximately 15 months after diagnosis. The low effect of chemotherapy and radiotherapy is largely due to the development of resistance. Therefore, an increase in the effectiveness of chemo- and radiotherapy is urgently required. Artesunate, an anti-malaria agent, that inhibits cell division in cancer cells in vitro, was combined with temozolomide and irradation in the present study and the effect of this combination was analysed. A fundamental point of the work was the question whether this combination has a positive impact on the effectiveness of tumor therapy and, if so, which mechanisms are responsible for it. Furthermore, it should be investigated whether a treatment established in vitro can be successfully applied to in vivo models. One of the most important and most commonly used chemotherapeutic agents for glioblastomas is temozolomide, which induces DNA damage, as does radiation. In the glioblastoma cells, these lead to a cell cycle arrest, induction of cell death, but also to the induction of survival mechanisms such as autophagy and senescence. In this study, both temozolomide and irradiation were combined with artesunate in a new approach. To establish the in vitro treatment scheme, cell death analyses were carried out on three glioblastoma cell lines for different doses of artesunate and different treatment duration, as well as various therapy sequences of single treatment and combination therapy. The combination with artesunate resulted in a significant increase in the effectiveness compared to the single treatments. After the establishment of the sequential combination treatment, the question arose about the underlying mechanisms. One of the first hypotheses based on already published results aimed at the genotoxic effect of all three noxes: since both temozolomide, irradiation and artesunate induce DNA damage, the accumulation of DNA damage led to increased toxicity. This hypothesis could not be confirmed by the analysis of proteins of the DNA damage response. Further analyses combined with findings from the literature led to the hypothesis that the increased toxicity of the combination is based on the inhibition of survival mechanisms such as autophagy and senescence induced by temozolomide and which could be responsible for the formation of resistances. The studies ultimately confirmed that artesunate acts on the temozolomide-induced autophagy and inhibits the senescence induced by temozolomide. In this study the inhibition of senescence led to an increase in the toxicity and thus an increase in the effectiveness of chemotherapy. The in vitro established treatment scheme was successfully transferred to a subcutaneous and following an intracranial tumor model in the mouse. The increase in the effectiveness of the combination treatment could be confirmed in the two mouse models. The intracranial model showed a 40% longer lifetime of the mice with combined treatment of artesunate and temozolomide compared to the treatment with temozolomide alone. The results of this study show that the efficient enhancement of chemotherapy by artesunate is due to the inhibition of the cell survival mechanisms induced by the treatment. The improved therapeutic results of the sequential treatment with temozolomide and artesunate thus offer a promising strategy for future cancer treatment, which should be investigated in clinical trials.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4592
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008851
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xvi, 235, V Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen