Autoren:	Krömmelbein, Natascha
Titel:	Analyse der Cytomegalovirus-Infektion in Adenovirus Typ 5 E1A/E1B-transformierten Zellen zur Entwicklung eines Zellsubstrats für die Impfstoffproduktion
Online-Publikationsdatum:	12-Apr-2016
Erscheinungsdatum:	2016
Sprache des Dokuments:	Deutsch
Zusammenfassung/Abstract:	Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein weit verbreiteter Krankheitserreger, der insbesondere bei Neugeborenen und Patienten mit eingeschränktem Immunsystem lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird der Entwicklung eines HCMV-Impfstoffs höchste Priorität zugeordnet. Nicht-infektiöse, subvirale Partikel, so genannte Dense Bodies (DBs), stellen aufgrund ihrer Immunogenität eine vielversprechende Basis für die Entwicklung eines HCMV-Impfstoffes dar. In vitro werden DBs in großen Mengen von infizierten, primären Fibroblasten (HFF) freigesetzt und können anschließend aus Zellkulturüberstand aufgereinigt werden. Primärzellkulturen wie HFF sind jedoch für die Impfstoff-Herstellung mit einer Reihe von Problemen behaftet. Zelllinien, die durch transformierende Funktionen onkogener Viren immortalisiert sind, stellen ein attraktives, alternatives Zellsubstrat zur Impfstoff-Herstellung dar. Die bislang untersuchten, derartigen Linien hatten sich jedoch einer produktiven HCMV-Vermehrung und, damit verbunden, einer DBs-Produktion gegenüber als resistent erwiesen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die von Cevec Pharmaceuticals GmbH zur Verfügung gestellte Zelllinie CAP, die mit den Adenovirus Typ 5 Proteinen E1A und E1B immortalisiert ist, auf die Fähigkeit hin zu untersuchen, HCMV zu replizieren und neben infektiösen Viren auch DBs in den Zellkulturüberstand freizusetzen. Die ersten Untersuchungen zeigten, dass HCMV CAP-Zellen effizient infizieren kann und seine immediate early (IE)-Gene exprimiert. In der Tat konnten infektiöse Virusnachkommen und DBs im Zellkulturüberstand infizierter CAP-Zellen nachgewiesen werden. Damit wurde erstmalig HCMV-Vermehrung in einer durch adenovirale Proteine transformierten Zelllinie gezeigt. Die dabei freigesetzten Mengen an DBs und infektiösen Virionen, lagen allerdings deutlich unter denen, die aus Überständen von HFF-Kulturen erhalten wurden. In den folgenden Untersuchungen sollten die Ursachen für diese Diskrepanz aufgeklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die HCMV-Infektion in CAP-Zellen zu einer Auflösung von sog. ND10-Domänen führt. Diese Strukturen sind Teil der angeborenen, antiviralen Abwehrsysteme der Zelle. Erst ihre Auflösung ermöglicht die virale Vermehrung. Im Weitern konnte virale early und auch early-late Geneexpression, wie auch virale DNA-Replikation in CAP-Zellen nachgewiesen werden. Dies zeigte, dass die grundlegenden Mechanismen der permissiven HCMV-Infektion von CAP-Zellen unterstützt werden. Jedoch fanden sich auch hier deutliche, quantitative Unterschiede zu HFF. Ausdruck der begrenzten Replikation viraler Genome und eingeschränkten Expression viraler Strukturproteine war die niedrige Anzahl an Viruspartikeln, die in elektronenoptischen Untersuchungen in CAP-Zellen gefunden wurden. Weiterführende Untersuchungen deuteten darauf hin, dass Unterschiede in der Zellzyklus-Kontrolle zwischen CAP-Zellen und HFF für den Unterschied in der Produktivität gegenüber Virusvermehrung verantwortlich sein könnten. Die Eigenschaft der adenoviralen E1-Proteine zur Stimulation des Zellzyklus wurde als möglicherweise hemmend für die HCMV-Replikation identifiziert. So konnte gezeigt werden, dass sich CAP-Zellen zum Zeitpunkt der Virusinfektion bevorzugt in der S-Phase des Zellzyklus befinden. Die S-Phase ist primär restriktiv für die initiale Genexpression und Replikation von HCMV. Zusammenfassend deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass die Expression der adenoviralen E1-Proteine in CAP-Zellen die HCMV-Replikation nicht verhindern, aber durch Einflussnahme auf verschiedene Funktionen der Wirtszelle hemmen. Die gezielte Modifikation der E1A/E1B Funktionen bietet einen attraktiven Ansatz, die HCMV-Infektion in CAP-Zellen gezielt zu unterstützen. Diese Arbeit hat somit wichtige Erkenntnisse erbracht, die als Grundlage für die Anpassung von HCMV an CAP-Zellen und die Optimierung der Produktion von DBs dienen. The human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen which causes severe disease manifestations both in newborns and in immunocompromised individuals. Because of the clinical relevance, the development of a vaccine against HCMV has gained top priority in biomedical research. The immunogenicity of non-infectious subviral particles, so called Dense Bodies (DBs), renders them a promising basis for vaccine development. DBs are released in large amounts in vitro from infected primary fibroblasts (HFF) and can easily be purified from HFF culture supernatants by gradient centrifugation. Vaccine production in primary cell cultures like HFF is, however, associated with several restrictions. Permanent cell lines established by transfection of the transforming functions of DNA tumor viruses provide an attractive, alternative cell substrate for vaccine manufacturing. The lines that had been tested for this purpose thus far have, however, been notoriously resistant to HCMV replication and progeny production. The main goal of this work was to test the CAP cell line for its suitability to replicate HCMV and to release infectious virus as well as DBs. CAP cells were provided by Cevec Pharmaceuticals GmbH. They had been immortalized by the adenovirus type 5 early proteins E1A and E1B. Initial testing showed that HCMV was able to efficiently penetrate CAP cells and to start its immediate early (IE) gene expression. Infectious virus could indeed be detected in the culture supernatants of CAP cells. This was the first time that productive infection of HCMV could be demonstrated in cells transformed by adenoviral proteins. The infectious titer and the number of DBs were, however, substantially lower compared to what was normally seen in HFF cultures. Subsequent analyses were therefore conceived to address the reasons for this discrepancy. It could be demonstrated that HCMV infection of CAP cells leads to the disruption of ND10 domains. These structures are part of the innate, antiviral response and their dissolution is a prerequisite for the initiation of productive HCMV infection. Viral early and early-late gene expression could be demonstrated in further analyses. This showed that the basic mechanisms of permissive HCMV infection are supported by CAP cells. There were, however, again marked quantitative differences to HFF infection noted. A reflection of the restricted replication of viral genomes and the low-level expression of viral structural proteins was the low number of viral particles that were detectable in late-stage infected CAP cells by electron microscopy. Further analyses indicated that differences in cell-cycle control between CAP cells and HFF were at least in part responsible for the low productivity of the former. The cell cycle stimulation mediated by adenoviral E1-proteins was identified as being putatively inhibitory to HCMV replication in CAP cells. It could be demonstrated that CAP cells were preferentially cycling through S-phase at the time of HCMV infection. The S-phase is, however, restrictive to immediate-early gene expression of HCMV, thus preventing high level viral replication. These results showed that adenoviral E1-proteins expressed in CAP cells do not block HCMV infection. Yet their influence on the host cell at various levels is likely restrictive to HCMV replication. Targeted intervention with E1A/E1B functions may provide an attractive strategy to support HCMV replication in CAP cells. This work has provided valuable knowledge for the adaptation of HCMV on CAP cells and for the optimization of DBs-production in these cultures.
DDC-Sachgruppe:	610 Medizin 610 Medical sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4551
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000003756
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang:	130 S.
Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen