Analyse der Cytomegalovirus-Infektion in Adenovirus Typ 5 E1A/E1B-transformierten Zellen zur Entwicklung eines Zellsubstrats für die Impfstoffproduktion
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Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein weit verbreiteter Krankheitserreger, der insbesondere bei Neugeborenen und Patienten mit eingeschränktem Immunsystem lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird der Entwicklung eines HCMV-Impfstoffs höchste Priorität zugeordnet. Nicht-infektiöse, subvirale Partikel, so genannte Dense Bodies (DBs), stellen aufgrund ihrer Immunogenität eine vielversprechende Basis für die Entwicklung eines HCMV-Impfstoffes dar. In vitro werden DBs in großen Mengen von infizierten, primären Fibroblasten (HFF) freigesetzt und können anschließend aus Zellkulturüberstand aufgereinigt werden. Primärzellkulturen wie HFF sind jedoch für die Impfstoff-Herstellung mit einer Reihe von Problemen behaftet. Zelllinien, die durch transformierende Funktionen onkogener Viren immortalisiert sind, stellen ein attraktives, alternatives Zellsubstrat zur Impfstoff-Herstellung dar. Die bislang untersuchten, derartigen Linien hatten sich jedoch einer produktiven HCMV-Vermehrung und, damit verbunden, einer DBs-Produktion gegenüber als resistent erwiesen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die von Cevec Pharmaceuticals GmbH zur Verfügung gestellte Zelllinie CAP, die mit den Adenovirus Typ 5 Proteinen E1A und E1B immortalisiert ist, auf die Fähigkeit hin zu untersuchen, HCMV zu replizieren und neben infektiösen Viren auch DBs in den Zellkulturüberstand freizusetzen. Die ersten Untersuchungen zeigten, dass HCMV CAP-Zellen effizient infizieren kann und seine immediate early (IE)-Gene exprimiert. In der Tat konnten infektiöse Virusnachkommen und DBs im Zellkulturüberstand infizierter CAP-Zellen nachgewiesen werden. Damit wurde erstmalig HCMV-Vermehrung in einer durch adenovirale Proteine transformierten Zelllinie gezeigt. Die dabei freigesetzten Mengen an DBs und infektiösen Virionen, lagen allerdings deutlich unter denen, die aus Überständen von HFF-Kulturen erhalten wurden. In den folgenden Untersuchungen sollten die Ursachen für diese Diskrepanz aufgeklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die HCMV-Infektion in CAP-Zellen zu einer Auflösung von sog. ND10-Domänen führt. Diese Strukturen sind Teil der angeborenen, antiviralen Abwehrsysteme der Zelle. Erst ihre Auflösung ermöglicht die virale Vermehrung. Im Weitern konnte virale early und auch early-late Geneexpression, wie auch virale DNA-Replikation in CAP-Zellen nachgewiesen werden. Dies zeigte, dass die grundlegenden Mechanismen der permissiven HCMV-Infektion von CAP-Zellen unterstützt werden. Jedoch fanden sich auch hier deutliche, quantitative Unterschiede zu HFF. Ausdruck der begrenzten Replikation viraler Genome und eingeschränkten Expression viraler Strukturproteine war die niedrige Anzahl an Viruspartikeln, die in elektronenoptischen Untersuchungen in CAP-Zellen gefunden wurden. Weiterführende Untersuchungen deuteten darauf hin, dass Unterschiede in der Zellzyklus-Kontrolle zwischen CAP-Zellen und HFF für den Unterschied in der Produktivität gegenüber Virusvermehrung verantwortlich sein könnten. Die Eigenschaft der adenoviralen E1-Proteine zur Stimulation des Zellzyklus wurde als möglicherweise hemmend für die HCMV-Replikation identifiziert. So konnte gezeigt werden, dass sich CAP-Zellen zum Zeitpunkt der Virusinfektion bevorzugt in der S-Phase des Zellzyklus befinden. Die S-Phase ist primär restriktiv für die initiale Genexpression und Replikation von HCMV. Zusammenfassend deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass die Expression der adenoviralen E1-Proteine in CAP-Zellen die HCMV-Replikation nicht verhindern, aber durch Einflussnahme auf verschiedene Funktionen der Wirtszelle hemmen. Die gezielte Modifikation der E1A/E1B Funktionen bietet einen attraktiven Ansatz, die HCMV-Infektion in CAP-Zellen gezielt zu unterstützen. Diese Arbeit hat somit wichtige Erkenntnisse erbracht, die als Grundlage für die Anpassung von HCMV an CAP-Zellen und die Optimierung der Produktion von DBs dienen.