Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4520
Authors: Balogh, Marta Kinga
Title: Forensisch relevante SNP-Genotypisierung mittels elektronischer Microarray-Technologie
Online publication date: 24-Aug-2009
Language: german
Abstract: Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-geförderten Projektes, das die Anwendungsmöglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die übergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflösende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren können. Zunächst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewählt, dass sie als Multiplex eine möglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschließend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot™-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits für die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage für die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenständige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays für die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewählt. Nach zahlreichen Optimierungsmaßnahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gerätespezifischer Abläufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschließend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot™-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie für bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilität und Effizienz. Die Automatisierung, welche die räumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermöglicht, reduziert unnötige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhäufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlässigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablösung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergänzung zur Lösung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.
This thesis emerged within a framework of an international project supported by European Union to examine the application of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) for individualization of persons in context of the assignment of biological traces from a crime scenario or the identification of unknown victims. The overall objectives of the project were the validation and evaluation of high throughput technologies for typing SNPs in a multiplex format with high accuracy but little effort. Initially a panel of 29 Y- chromosomal and 52 autosomal SNPs respectively have been selected based upon criteria that they achieve a high discrimination index. Both multiplexes were validated in systematic studies with participation of all working groups of the project by using SNaPshot™ minisequencing. This method was then used as a reference technology for the development of different SNP genotyping assays. The independent main part of this thesis describes the new development and validation of a hybridization assay for the NanoChipTM electronic microarray platform using previously validated autosomal SNPs. This instrument is fully automated and uses a proprietary semiconductor microchip for rapid electronic addressing of samples or capture probes to specific array sites, followed by passive hybridisation of fluorescently labeled reporter oligos. Discrimination is achieved by applying thermal, electronical or chemical stringency to denature the mismatched reporters. Allele calling is carried out immediately using a built-in laser-activated fluorescence detection system. Three different assays distinguished in the operating principle have been established on the microarray. The capture down assay has been selected for further development, because this protocol is most suitable for analysis of multiplex PCR. After performing numerous optimizations regarding the handling of PCR products, device-specific procedures, and analysis-specific oligonucleotide design, the capture down assay was validated for simultaneous typing of three individuals, each with 32 SNPs, on a single microarray. Subsequently, the evaluation of the assay was carried out by using 40 DNA samples with known genotypes, and the accuracy was determined by parallel SNaPshot™ typing. The results demonstrate not only the suitability of the validated assays and analysis of electronic microarray technology for certain issues, but also show their advantages in terms of speed, flexibility and efficiency. The automation allowing the spatial arrangement of the DNA fragments immediately prior the analysis reduces work steps and thus the incidence of errors and contamination risks with improved efficiency. However, with a maximum accuracy of 94%, the reliability of STR systems currently used in forensic genetics could not be achieved. Therefore a possible role of the new technology is not a replacement of the established STR methods, but a supplement to resolve specific problems such as investigating highly degraded DNA of low quantity.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4520
URN: urn:nbn:de:hebis:77-20639
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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