Authors:	Farcas, Ruxandra Denisa
Title:	Comparative DNA sequence and methylation analyses of orthologous genes in humans and non-human primates: Genetic and epigenetic footprints of evolution
Online publication date:	13-Jul-2009
Year of first publication:	2009
Language:	english
Abstract:	Welche genetische Unterschiede machen uns verschieden von unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen, und andererseits so ähnlich zu den Schimpansen? Was wir untersuchen und auch verstehen wollen, ist die komplexe Beziehung zwischen den multiplen genetischen und epigenetischen Unterschieden, deren Interaktion mit diversen Umwelt- und Kulturfaktoren in den beobachteten phänotypischen Unterschieden resultieren. Um aufzuklären, ob chromosomale Rearrangements zur Divergenz zwischen Mensch und Schimpanse beigetragen haben und welche selektiven Kräfte ihre Evolution geprägt haben, habe ich die kodierenden Sequenzen von 2 Mb umfassenden, die perizentrischen Inversionsbruchpunkte flankierenden Regionen auf den Chromosomen 1, 4, 5, 9, 12, 17 und 18 untersucht. Als Kontrolle dienten dabei 4 Mb umfassende kollineare Regionen auf den rearrangierten Chromosomen, welche mindestens 10 Mb von den Bruchpunktregionen entfernt lagen. Dabei konnte ich in den Bruchpunkten flankierenden Regionen im Vergleich zu den Kontrollregionen keine höhere Proteinevolutionsrate feststellen. Meine Ergebnisse unterstützen nicht die chromosomale Speziationshypothese für Mensch und Schimpanse, da der Anteil der positiv selektierten Gene (5,1% in den Bruchpunkten flankierenden Regionen und 7% in den Kontrollregionen) in beiden Regionen ähnlich war. Durch den Vergleich der Anzahl der positiv und negativ selektierten Gene per Chromosom konnte ich feststellen, dass Chromosom 9 die meisten und Chromosom 5 die wenigsten positiv selektierten Gene in den Bruchpunkt flankierenden Regionen und Kontrollregionen enthalten. Die Anzahl der negativ selektierten Gene (68) war dabei viel höher als die Anzahl der positiv selektierten Gene (17). Eine bioinformatische Analyse von publizierten Microarray-Expressionsdaten (Affymetrix Chip U95 und U133v2) ergab 31 Gene, die zwischen Mensch und Schimpanse differentiell exprimiert sind. Durch Untersuchung des dN/dS-Verhältnisses dieser 31 Gene konnte ich 7 Gene als negativ selektiert und nur 1 Gen als positiv selektiert identifizieren. Dieser Befund steht im Einklang mit dem Konzept, dass Genexpressionslevel unter stabilisierender Selektion evolvieren. Die meisten positiv selektierten Gene spielen überdies eine Rolle bei der Fortpflanzung. Viele dieser Speziesunterschiede resultieren eher aus Änderungen in der Genregulation als aus strukturellen Änderungen der Genprodukte. Man nimmt an, dass die meisten Unterschiede in der Genregulation sich auf transkriptioneller Ebene manifestieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Mensch und Schimpanse untersucht. Dazu wurden die Methylierungsmuster der Promotor-CpG-Inseln von 12 Genen im Cortex von Menschen und Schimpansen mittels klassischer Bisulfit-Sequenzierung und Bisulfit-Pyrosequenzierung analysiert. Die Kandidatengene wurden wegen ihrer differentiellen Expressionsmuster zwischen Mensch und Schimpanse sowie wegen Ihrer Assoziation mit menschlichen Krankheiten oder dem genomischen Imprinting ausgewählt. Mit Ausnahme einiger individueller Positionen zeigte die Mehrzahl der analysierten Gene keine hohe intra- oder interspezifische Variation der DNA- Methylierung zwischen den beiden Spezies. Nur bei einem Gen, CCRK, waren deutliche intraspezifische und interspezifische Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung festzustellen. Die differentiell methylierten CpG-Positionen lagen innerhalb eines repetitiven Alu-Sg1-Elements. Die Untersuchung des CCRK-Gens liefert eine umfassende Analyse der intra- und interspezifischen Variabilität der DNA-Methylierung einer Alu-Insertion in eine regulatorische Region. Die beobachteten Speziesunterschiede deuten darauf hin, dass die Methylierungsmuster des CCRK-Gens wahrscheinlich in Adaption an spezifische Anforderungen zur Feinabstimmung der CCRK-Regulation unter positiver Selektion evolvieren. Der Promotor des CCRK-Gens ist anfällig für epigenetische Modifikationen durch DNA-Methylierung, welche zu komplexen Transkriptionsmustern führen können. Durch ihre genomische Mobilität, ihren hohen CpG-Anteil und ihren Einfluss auf die Genexpression sind Alu-Insertionen exzellente Kandidaten für die Förderung von Veränderungen während der Entwicklungsregulation von Primatengenen. Der Vergleich der intra- und interspezifischen Methylierung von spezifischen Alu-Insertionen in anderen Genen und Geweben stellt eine erfolgversprechende Strategie dar. What genetic changes make us different from our closest relative, the chimpanzee, and on the other hand at the same time similar? What we really want to explore and understand is actually a complex relationship between multiple genetic and epigenetic differences which interact with diverse environmental and cultural factors resulting in the observed phenotypic differences. In order to elucidate whether or not chromosomal rearrangements contribute to the human-chimpanzee divergence and which are the selective forces that have shaped their evolution, I have analyzed the coding sequences of 2 Mb regions flanking the pericentric inversion breakpoints on chromosomes 1, 4, 5, 9, 12, 17, 18. Collinear regions of 4 Mb on rearranged chromosomes that are separated by at least 10 Mb from the breakpoint regions served as controls. Collectively, I did not observe a higher rate of protein evolution in the breakpoint flanking regions compared to the control region. My results do not support the chromosomal speciation hypothesis for humans and chimps because the proportion of positively selected genes (5.1% in breakpoints flanking regions and 7% in the control region), was similar in the two regions. By comparing the numbers of positively and negatively selected genes per chromosome, I found that chromosome 9 contains the highest number of PSGs in both breakpoint and control regions, whereas chromosome 5 carries the lowest number of selected genes. The number of genes under purifying selection (68) was found to be much higher than the number of positively selected genes (17). Bioinformatic analysis of published microarray expression data (affimetrix chip U95 and U133v2) revealed 31 genes which are differentially expressed between human and chimpanzee. By analysing the dN/dS ratio of these 31 genes, I found 7 genes under purifying selection but only one positively selected gene. This is consistent with the idea that genes expression levels evolve under the stabilizing selection. Most of the PSGs play a role in reproduction. Many of these species differences may be due to changes in gene regulation rather than structural changes in the gene products. Most differences in gene regulation are believed to occur at the transcriptional level. In this study I focused on the differences in the DNA methylation pattern between species. By classical bisulfite sequencing and pyrosequencing, I analyzed the CpG island promoter methylation patterns of 12 genes in human and chimpanzee cortex. The candidate genes were selected because of their differential expression pattern between human and chimpanzee or because of their association with human disease or imprinting. With the exception of a few individual sites, the majority of the analysed genes did not present a high intra or interspecific variation of DNA methylation between these two species. Only one gene CCRK, appeared to exhibit considerable intraspecific and interspecific variation in the degree of methylation. This differentially methylated CpG sites lie within an Alu-Sg1 repeat. The study of CCRK gene provides a comprehensive analysis of the intra- and interspecific variability of DNA methylation of an Alu insertion in a regulatory region. The observed species differences suggest that the CCRK methylation patterns evolve under positive selection, probably in adaptation to specific requirements for fine-tuning of CCRK regulation. The CCRK promoter is susceptible to epigenetic modification by DNA methylation, which could result in complex patterns of transcription. Because of their genomic mobility, high CpG content and their effect on gene expression Alu insertions are extremely attractive candidates for promoting changes in the developmental regulation of primates genes. The intra and interspecific methylation comparisons of specific Alu insertions in other genes and tissues is a promising strategy.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4494
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-20309
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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