Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4477
Authors: Baumhauer-Klein, Stefanie
Title: Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula
Online publication date: 24-Jun-2009
Language: german
Abstract: Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 ( proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können
Sponges are, due to their living conditions exposed to numerous exterior threats. As marine sessile filter feeders they filtrate huge amounts of water (0.002–0.84 ml/s/cm3 of sponge tissue) through their aquiferous canal system to extract edible material. Therefore they are exposed to large amounts of microorganisms such as bacteria and viruses that are present in seawater. This requires efficient defence strategies like apoptosis and an immune system which ensure surviving of the organism as well as removal of damaged, infected or redundant cells. Analyses of poriferan molecules during the last years revealed the existence of some proteins which are involved in this processes. Examples are the apoptotic proteins GCDD2, GCBHP1 and GCBHP2 (Wiens et al., 2001), as well as an LPS inducible TNF (Wiens et al., 2007) and two capsizes (Wines et al., 2003) and immunological proteins like a TLR-like protein (Wines et al., 2007). To understand these processes and to identify further mechanisms the SpongeBase databank should be screened for a prospective TNF-receptor. Therefore it was searched for proteins which include a death domain and candidates were found and completed from cDNA of the marine sponge S. domuncula using PCR and screening methods. Afterwards one clone, which showed the highest homology with a TNF-receptor death domain, was chosen for further characterisations. Sequence and structure analyses of this SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologous) protein revealed the existence of an additional domain (Ubiquitin-like). In a „Yeast Two Hybrid Screen“ proteins could be identified which were interacting with the SD_TNFR-like. Thereby a protein could be identified which showed homology to an antimicrobial peptide. This protein (SD_Brevinin-like) was used for several analyses. It could be showed that this protein can be cleaved in three parts as it is known from a group of antimicrobial peptides, the α-helical cationic peptides. Cleavage of an anionic propeptid as well as a signal peptide generates the active peptide which showed antimycotic activity in an antimicrobial test. As these proteins are expected to be part of defence reactions in the sponge their expression should be up regulated after exposure with microbial compounds. This could be proved for the SD_Brevinin-like during northern blot analyses after incubation of tissue with LPS, PAM and yeast. SD_TNFR-like expression was up regulated as well after incubation with LPS and TNF-α as shown during northern and dot blot analyses. But the up regulation was not as strong as the one for the SD_Brevinin-like. This result could be proved on the protein level in western blot analyses with a gene specific antibody that was generated for the SD_TNFR-like protein. Furthermore a test with -Blue™-cells was done to characterise the function of the SD_TNFR-like protein. The result as well as the fact that the interactor is an antimicrobial peptide implies that the protein is part of the immunological TLR resp. NLR like reaction and preserves the organism from microbial invaders. This thesis was provided with the identification of a TRAF2 binding site during structural analyses. This protein acts as an adapter of TNF-receptors which leads to activation of the NF - B pathway to ensure the surviving of the organism. Therefore it is conceivable that both proteins are part of the sponge immunresponse. SD_TNFR-like protein can prevent apoptosis and activate surviving mechanisms while SD_Brevinin-like protein possesses antimycotical activity. Furthermore it seems as if it acts as a regulatory factor for the SD_TNFR-like protein which modulates its activity. Nevertheless further functional analyses are required to characterise the particular effects and the regulation of the SD_TNFR-like protein.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4477
URN: urn:nbn:de:hebis:77-20069
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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