Suppression of hepatic fibrosis by efficient Col1a1 silencing using shRNA inducible mouse models
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Die Leberfibrose ist eine chronische Wundheilungsreaktion der Leber bei chronischer Schädigung. Sie kann zur Zirrhose und zum Leberzellkarzinom führen, die die Hauptursachen der erhöhten Morbidität und Mortalität chronischer Lebererkrankungen sind. Die Leberfibrose ist durch eine überschüssige Ablagerung von Narbengewebe (extrazellulärer Matrix, EZM) charakterisiert, die hauptsächlich aus interstitiellen Kollagenen besteht, mit Kollagen Typ I als einer Hauptkomponenete und zahlreichen andere strukturellen und funktionellen Molekülen.
In dieser Arbeit wurde RNAi-Mausodelle genereiert, die einen hocheffizienten „Knockdown“ von Col1a1, welches für die essenzielle Kette des tripelhelikalen Prokollagen Typ I kodiert, um die Rolle des Kollagen Typ I bei der Entwicklung der Leberfibrose zu untersuchen und den Effekt neuartiger, spezifischer, auf die Kollagen Typ I-Synthese abzielender anti-fibrotischer Therapien vorherzusagen.
Um durch RNA-Interferenz (RNAi) induzierbare Mausmodelle mit einem Col1a1 „Knockdown“ zu generieren, wurden zwei verschiedene effektive Methoden eingesetzt: Kassettenaustauschverfahren in embryonalen Stammzellen und Zinkfingernuklease-mediierte Genom-Editierung. Beide Methoden wurden so eingesetzt, dass die Targeting Kassette, die das „enhanced green fluorescent protein“ (EGFP) und „short hairpin-RNA (shRNA) targeting Col1a1“ enthalten, in den Locus des Prokollagen α1(I) Gens (jenseits des 3’ UTR Col1a1-Locus) eingebracht wurde. Zu diesem Zweck wurde zwei verschiedenen shRNAs selektiert und validiert, und in den Kontext des miR30 Lokus einkloniert worden.
ShRNACol1a1-7 wurde für die Herstellung der die Tetrazyklin (Tet)-regulierbaren shRNA exprimierenden Mäuse bei dem Kassettenaustauschverfahren in KH2 embryonalen Stammzellen verwendet. Das (Tet)-regulierbare shRNACol1a1-4 Gen wurde im gleichen Genort bei der ZFN-abhängigen homologen Rekombination unmittelbar in befruchteten Eizellen eingesetzt.
Um die neuen induzierbaren RNAi Col1a1 transgenen Mäuse zu charakterisieren, wurden die Tiere mit der Rosa26-M2rtTA Linie, die die weit verbreitete Expression des reversen Tetrazyklin-abhängigen Transaktivators (rtTA) erlaubt, gekreuzt. Die transgene Mäuse und die Wildtyp (WT)-Kontrolltiere wurden drei Wochen lang mit eskalierenden Dosen CCl4 behandeln, um eine parenchymatöse Leberfibrose und die gleichzeitige Expression der shRNAs Col1a1 und des EGFP Reporterprotein zu induzieren.
Die Tet-induzierten bi-transgenen Mäuse zeigten eine 80-90%ige Suppression der der Prokollagenes α1(I) mRNA-Expression und eine 40-50%ige Reduzierung der Kollagen-Ablagerung in der Leber im Vergleich zu den fibrotischen WT-Mäusen. Interessanterweise führte der Prokollagen α1(I) “knockdown” auch zu einer Suppression der Expression, sondern auch der Expression der Prokollagene Typ III, IV und VI sowie andere Fibrose-assoziierter Gene. Dies war mit einer Abschwächung der chronischen Entzündung begleitet, was darauf hindeutet, dass Kollagen Typ I nicht nur eine wichtige Komponente des Narbengewebes darstellt, sondern auch als Modulator anderer Kollagene und als Promoter der chronischen Entzündung selbst dient.