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Authors: Molokanova, Olena
Title: Suppression of hepatic fibrosis by efficient Col1a1 silencing using shRNA inducible mouse models
Online publication date: 12-Jul-2018
Language: english
Abstract: Die Leberfibrose ist eine chronische Wundheilungsreaktion der Leber bei chronischer Schädigung. Sie kann zur Zirrhose und zum Leberzellkarzinom führen, die die Hauptursachen der erhöhten Morbidität und Mortalität chronischer Lebererkrankungen sind. Die Leberfibrose ist durch eine überschüssige Ablagerung von Narbengewebe (extrazellulärer Matrix, EZM) charakterisiert, die hauptsächlich aus interstitiellen Kollagenen besteht, mit Kollagen Typ I als einer Hauptkomponenete und zahlreichen andere strukturellen und funktionellen Molekülen. In dieser Arbeit wurde RNAi-Mausodelle genereiert, die einen hocheffizienten „Knockdown“ von Col1a1, welches für die essenzielle Kette des tripelhelikalen Prokollagen Typ I kodiert, um die Rolle des Kollagen Typ I bei der Entwicklung der Leberfibrose zu untersuchen und den Effekt neuartiger, spezifischer, auf die Kollagen Typ I-Synthese abzielender anti-fibrotischer Therapien vorherzusagen. Um durch RNA-Interferenz (RNAi) induzierbare Mausmodelle mit einem Col1a1 „Knockdown“ zu generieren, wurden zwei verschiedene effektive Methoden eingesetzt: Kassettenaustauschverfahren in embryonalen Stammzellen und Zinkfingernuklease-mediierte Genom-Editierung. Beide Methoden wurden so eingesetzt, dass die Targeting Kassette, die das „enhanced green fluorescent protein“ (EGFP) und „short hairpin-RNA (shRNA) targeting Col1a1“ enthalten, in den Locus des Prokollagen α1(I) Gens (jenseits des 3’ UTR Col1a1-Locus) eingebracht wurde. Zu diesem Zweck wurde zwei verschiedenen shRNAs selektiert und validiert, und in den Kontext des miR30 Lokus einkloniert worden. ShRNACol1a1-7 wurde für die Herstellung der die Tetrazyklin (Tet)-regulierbaren shRNA exprimierenden Mäuse bei dem Kassettenaustauschverfahren in KH2 embryonalen Stammzellen verwendet. Das (Tet)-regulierbare shRNACol1a1-4 Gen wurde im gleichen Genort bei der ZFN-abhängigen homologen Rekombination unmittelbar in befruchteten Eizellen eingesetzt. Um die neuen induzierbaren RNAi Col1a1 transgenen Mäuse zu charakterisieren, wurden die Tiere mit der Rosa26-M2rtTA Linie, die die weit verbreitete Expression des reversen Tetrazyklin-abhängigen Transaktivators (rtTA) erlaubt, gekreuzt. Die transgene Mäuse und die Wildtyp (WT)-Kontrolltiere wurden drei Wochen lang mit eskalierenden Dosen CCl4 behandeln, um eine parenchymatöse Leberfibrose und die gleichzeitige Expression der shRNAs Col1a1 und des EGFP Reporterprotein zu induzieren. Die Tet-induzierten bi-transgenen Mäuse zeigten eine 80-90%ige Suppression der der Prokollagenes α1(I) mRNA-Expression und eine 40-50%ige Reduzierung der Kollagen-Ablagerung in der Leber im Vergleich zu den fibrotischen WT-Mäusen. Interessanterweise führte der Prokollagen α1(I) “knockdown” auch zu einer Suppression der Expression, sondern auch der Expression der Prokollagene Typ III, IV und VI sowie andere Fibrose-assoziierter Gene. Dies war mit einer Abschwächung der chronischen Entzündung begleitet, was darauf hindeutet, dass Kollagen Typ I nicht nur eine wichtige Komponente des Narbengewebes darstellt, sondern auch als Modulator anderer Kollagene und als Promoter der chronischen Entzündung selbst dient.
Hepatic fibrosis results from a chronic wound-healing response of the liver. It may progress to cirrhosis and primary liver cancer, which are the major causes of liver related morbidity and mortality. Hepatic fibrosis is characterized by chronic inflammation that causes excess deposition of scar tissue (extracellular matrix, ECM), mainly composed of interstitial collagens such as collagen type I and other structural and functional components of the ECM. This study focused on generation of RNAi mouse models that provide a highly efficient downregulation of Col1a1 (alpha-1 type I procollagen) to address the role of collagen type I in development of liver fibrosis and to predict the effect novel specific, collagen type I directed anti-fibrotic therapies. To create mice with inducible RNA interference (RNAi) to knockdown Col1a1, two modern efficient methods of gene targeting were used: recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) in embryonic stem cells and zinc-finger nuclease (ZFN)-aided genomic targeting. Using these methods, a targeting cassette carrying the tetracycline responsive element (TRE), enhanced green fluorescent protein (EGFP) and sh(short hairpin)RNA targeting Col1a1 were inserted in the predefined locus downstream 3’ UTR of the Col1a1 gene. For this propose two different shRNAs were screened, validated and cloned in the context of miR30, which permits a more efficient suppression of gene expression than traditional stem-loop shRNAs. ShRNACol1a1-7 was used for creating the Tet-regulated shRNA expressing mice using RMCE in KH2 embryonic stem (ES) cells, while the Tet-controlled shRNACol1a1-4 was integrated in the same genomic location using ZFN assisted homologous recombination directly in fertilized oocytes. To analyze the new tetracycline inducible RNAi Col1a1 transgenic mice, they were bred with the Rosa26-M2rtTA strain that provides widespread expression of the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA-M2) protein. Transgenic mice and the wild type (WT) control group were treated with escalating doses of oral CCl4 for three weeks to induce parenchymal liver fibrosis and at the same time with doxycycline to induce expression of Col1A1 shRNAs and EGFP reporter protein. Bi-transgenic mice showed an 80-90% suppression of procollagen alpha1(I) transcription and a 40-50% reduction in hepatic collagen accumulation in comparison with the fibrotic WT controls. Interestingly, the induced procollagen alpha1(I) knockdown downregulated procollagens type III, IV and VI and other fibrosis related parameters. This was associated with attenuation of chronic inflammation, suggesting that collagen type I serves not only as major scar component, but also as a modulator of other collagens and of chronic inflammation.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4470
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 99 Blätter
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